没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。 　　通过荷兰脑库（阿姆斯特丹，荷兰，https://www.brainbank.nl）获得了事后脑组织。符合所有道德标准，大脑捐助者就其用于研究目的的脑组织和临床记录签署了知情同意。这项研究是在荷兰大脑银行，阿姆斯特丹大学医学中心（位置VUMC）和利兹大学进行的。这项研究得到VUMC和利兹大学研究伦理委员会的批准。根据脑网II（BNE）联盟（http://www.brainnet-europe.org）和NIA-AA54进行脑解剖和神经病理诊断。 　　将未固定的，固定的，快速的尸检后尸体AD和未痴呆的供体尸体后大脑存储在-80°C下，并为这些研究提供了组织来源。控制案例是一名90岁的男人，患有抑郁症和前列腺癌病史。在87岁那年，捐助者被送往疗养院。在最后阶段，他因浓度障碍而被动，但他没有痴呆，具有正常的语言技能，口语技能和沟通能力。神经病理学检查显示颞叶有轻微的萎缩。在颞叶中未观察到β-淀粉样斑块或神经原纤维缠结。 　　一个含有与HPF未固定组织相邻的暂时回旋的组织块，被福音固定并嵌入石蜡。制备了5 µm厚度的切片，并安装在超冻样+显微镜载玻片上（VWR）。在37°C的过夜孵育后，使用二甲苯和酒精将载玻片脱蜡，然后在磷酸盐缓冲盐水中洗涤（pH 7.4）。 　　如前所述55，斑块和神经原纤维缠结的组织化学检测为。简而言之，使用5％w/v周期酸预处理组织30分钟。随后，将组织使用0.035％w/v硝酸银溶液浸渍30分钟。银浸没后，使用开发溶液诱导的还原反应（2.5％W/v碳酸钠，0.1％W/v硝酸银，0.5％W/v隆型硫酸水合物，0.1％W/v硝酸盐和0.1％W/V/V型）。通过在0.5％w/v乙酸中洗涤5分钟，从5％w/v硫代硫酸钠洗涤5分钟来消除了未结合的银5分钟。使用血久毒素（对立）对切片进行了染色。使用酒精和二甲苯将切片脱水，并使用Depex（BDH实验室供应）覆盖。 　　对于免疫组织化学，将脱蜡的切片在磷酸盐缓冲盐水中用0.3％过氧化氢预处理30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后在10 mm柠檬酸钠缓冲液（pH 6）中加热（121°C 20分钟）进行抗原逆转。将一抗在室温下过夜孵育，并在抗体稀释剂（Sigma-Aldrich）中稀释，如下：抗PTAUSER202/THR205克隆AT8（Thermo Fisher）1：800，抗淀粉样beta beta beta克隆克隆4G8（Biolegend）1：1,000，ptau-thr217（po62-therptau-thr217）（po62-thermo-thr217），（BD Biosciences）1：1,000，抗α-突触核蛋白（Phosho-S129）（ABCAM）1：500和抗PTDP-43 Ser409/410（Cosmo Bio）（Cosmo Bio）稀释1：6,000和抗TMEMEMEM106B（C端，Sigma-Aldrich）稀释1,000。在次级检测步骤中使用了Envision小鼠/兔HRP（DAKO），并且将3,3'-二氨基苯甲嗪（Dako）用作发色原。使用血久毒素对免疫染色的切片进行对抗，使用酒精和二甲苯脱水，并使用Depex覆盖。 　　将自由浮动（200μm）急性脑切片在羧化的NMDG缓冲液中孵育1小时，将15μMMX04稀释至。Next, the slices were transferred to fresh NMDG buffer (93 mM NMDG, 2.5 mM potassium chloride, 1.2 mM sodium hydrogen carbonate, 20 mM HEPES, 25 mM glu​​cose, 5 mM sodium ascorbate, 2 mM thiourea, 3 mM sodium pyruvate, 10 mM magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 mM calcium氯化二水合物，pH 7.4，300–315 Mosmol）56，并用4％V/V降压甲醛固定。将切片用2％V/V Triton X-100透化30分钟，并在阻塞缓冲液中孵育1小时（3％w/v BSA，0.1％V/V Triton X-100，50 mm Tris-HCl，150 mm NaCl，NaCl，NaCl，pH 7.4）在室温下。为了检测β-淀粉样蛋白和tau夹杂物，将切片在1：750稀释6e10（Biolegend，CatalogNo。803001）或1：750稀释4G8（Biolegend，CatalogNo。803001）和1：750稀释AT8（热渔夫）中的16 H. 4°C中的1：1：750稀释率孵育1：750稀释。在TBS（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.4）中洗涤3次后，将切片在1：1,000稀释后的Antimouse IgG2B AF-633（Thermo Fisher，Thermo Fisher，CatalogNO。A21126）和1：1,000稀释的抗鼠IgG1 AF-5 AF-568（thermo fuldo fuldo flufffise）中（hando fuldo）（hhore fuldo fishere）中的温度下孵化。在TBS中进行三次洗涤5分钟后，将切片安装在显微镜载玻片（Erpredia，CatalogNo。J1810AMNZ）上的Vectashield（载体实验室）。使用共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 700）获取图像，使用A×10/0.3和A×63/1.4数值孔径（NA）空气物镜，分别为1,024×1,024和512×512 Pixels框架。MX04，AF-568和AF-633分别以405和435、579和603和639和669 nm的激发和发射最大值检测到。 　　Sarkosyl-Insoluble Tau纯化遵循先前发表的协议57。简而言之，将冻干后脑组织在均化缓冲液（10 mM Tris-HCI（pH 7.4），0.8 M NACI，1 mM EDTA，10％W/V蔗糖）中匀浆。将匀浆以20,000克离心20分钟，在4°C下，并保留上清液。将颗粒重新构成在均化缓冲液的5卷（w/v）中，并近期分离。将这两种上清液组合在一起，将1％的洛洛伊洛伊洛伊洛伊洛伊洛伊洛伊洛伊溶液（w/v）置于21°C时以100,000克离心1小时。将sarkosyl-solubleble颗粒重悬于50 mM Tris-HCl，pH 7.4（每克0 g 0.2 ml的起始材料）中，并在4°C下储存以进行免疫印迹。使用4–12％的BIS-Tris凝胶（Thermo Fisher）分析样品，并使用IBLOT凝胶转移堆栈（Thermo Fisher）转移到聚乙烯基二氟化物（PVDF）膜上。在室温下，PVDF膜被阻断（2.5％w/v酪蛋白，在0.1％V/V tween 20，50 mm Tris-HCl pH 7.4，100 mm NaCl）中持续1小时。将以下主要抗体在TBS-T中的1.25％w/v酪蛋白中稀释（0.1％Tris 20，50 mm Tris-Hcl pH 7.4，100 mm NaCl）：1：2,000 Tau 46（氨基酸（AA）（AA）（AA）404–441，404-441，T9450，T9450，MERCK），1：1,000 AT8（PS202/PTS202/pt throun），M. 1，五个TAUS，M. 1 000，MN，M.MN，M.MN4-重复tau（AA 275–291，目录号05-804，默克），1：500 3- repeat tau（AA 267-316，目录号05-803，Merck）和1：1,000 c-tensinal tmem106b（merck，catalog catalog catalog no。sab21067778888888）。将PVDF膜与4°C的一抗孵育过夜。将膜用TBS-T洗涤5次，持续5分钟，然后在室温下与二抗孵育40分钟，然后在TBS-T中洗涤5次，持续5分钟。带有ECL试剂（Lumigen）的PVDF膜在Ibright 1500（Thermo Fisher）上成像。 　　如先前所述的58，sarkosyl-solubleble tau的纯化。简而言之，将0.435 g验尸脑（扣带回回）组织在20卷（V/W）的均质缓冲液（10 mM Tris-HCI（pH 7.4），0.8 M NACI，1 mM EGTA，1 mm EGTA，10％W/V蔗糖）中匀浆。将匀浆液带到2％w/v sarkosyl，在37°C下孵育30分钟，然后在4°C下以10,000g离心10分钟。将上清液保留并在4°C下以100,000克离心25分钟。将sarkosyl-solubleble颗粒重悬于700μLG-1提取缓冲液（每克组织）中，并在4°C下以5,000g离心5分钟。将上清液在50 mM Tris-HCl，pH 7.4中稀释三倍，含有0.15 m NaCl，10％w/v蔗糖和0.2％w/v sarkosyl，在4°C下以166,000g旋转30分钟。将沉淀重悬于300μLG-1 EM缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM NaCl）中。 　　在60 s的血浆清洁步骤（tergeo，pie Scientific）后，将样品（4 µL）应用于Quantifoil R1.2/1.3（300网格）网格。使用Vitrobot Mark IV（FEI）在液态乙烷中污染网格，并在腔室保持接近100％湿度和6°C的腔室中。使用titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher）在Astbury生物结构实验室（LEEDS）的EPU V.3.0（Thermo Fisher）收集冷冻EM数据集，该数据集在计数模式下使用Falcon4i检测器以300 kV运行，使用Titan Krios Electron显微镜（Thermo Fisher）收集。设定的名义放大倍率为96,000，像素大小为0.83Å。总共收集了10,860个视频，标称的散焦范围为-1.5至-2.7 µm，在4 s的暴露中，总剂量约为44 E-/Å2，对应于剂量率约为7.6 E-/Pixel s -1。 　　原始的EER视频最初被压缩并使用Relion v.4.059转换为TIFF，并重组以每帧的剂量为1.2 E-/Å2，以获得38帧。使用运动校正（MotionCorr2 v.1.2.1）60（扩展数据图1C）对TIFF堆栈进行对齐并求和，并使用CTFFIND V.1.1461估算每个显微照片的对比度传递函数（CTF）参数。手动挑选了大约100个显微照片的tau原纤维，并用于在Crolo v.1.9.662中训练采摘模型，用于自动采摘，盒间间距为3×层（大约14Å）。接下来，将321,041个片段提取2×bin，大约560Å2盒尺寸。进行了两轮二维（2D）分类以去除摘除伪像，所有类对应于保存的原纤维（扩展数据图1D），产生279,590个段以进行进一步处理。使用RELION_HELIX_INIMODEL2D COMMANT63生成了从类似PHF的2D类平均值和估计的螺旋转换产生的初始3D模板。第一个3D分类使用所有2倍BIN的段进行，采样为1.8°，严格的高分辨率限制为6Å（扩展数据图1E），从中出现了两个类别的tau phf折叠率（总共72％）（总共72％（72％的段）（占阶段的较高阶段），其中包含24％的offermitive of sef coppertments和一个分类的coptecting（一个copting a）。将每个子集提取未扣除（336 pixel2，276Å2），并以0.9°采样进一步分类，而无需高分辨率极限，并且在局部搜索螺旋扭转的情况下（扩展数据图1F）。根据已知的结构数据，PHF子集的螺旋升高设置为2.4Å，SF子集的螺旋升高为4.8Å。SF子集图改进了，以显示与已发表的Tau SF结构相同的主链折叠24，但没有足够的片段来完善到高分辨率结构。PHF子集决定给出3.0Å （金色标准，傅立叶壳相关（FSC）为0.143）精制图（扩展数据图1G – I）CTF细化和贝叶斯抛光后，在后处理过程中施加了-57Å2。最终的精制螺旋上升和扭曲值分别为2.405Å和179.44°（补充表8）。 　　将已发表的tau PHF原纤维结构（蛋白质数据库（PDB）5O3L）24停靠到精制的冷冻EM图中，并使用COOT v.0.8.9.264中的真实空间完善，调整了一个链条以适应密度。将链条复制并停靠到密度中，以创建五层二聚体Tau多肽链。该模型是使用phenix v.1.17.165进行的真实空间，该模型具有用于限制链间差异的非结晶对称约束。最终模型的质量是使用Molprobity v.4.5.266评估的。最终模型与模板模型几乎相同，禁止轻微的侧链调整和像素大小和/或放大倍率的差异，而每个模型的链中的均方根偏差为0.67Å，用于73Cα位置（补充表8）。因此，该模型未沉积到PDB上，因为几个相同的tau PHF模型已经存在24。 　　Flash-frozen postmortem brain samples were thawed at room temperature for 5 min, then placed in ice-cold carboxygenated NMDG buffer (93 mM NMDG, 2.5 mM potassium chloride, 1.2 mM sodium hydrogen carbonate, 20 mM HEPES, 25 mM glu​​cose, 5 mM sodium ascorbate, 2 mM thiourea, 3 mM sodium pyruvate,10毫米硫酸镁七水合物，0.5 mm氯化钙二水合物，pH 7.4，300–315 mosmol）56。然后，使用冰冷的NMDG缓冲液（大约30分钟），使用沿水平或冠状平面（CatalogNo。VT1200，Leica，Leica，Leica，Leica，Leica，Leica）切割了100-200μm切片的邮政AD和对照供体脑（速度0.26 mm S-1）。接下来，在羧基NMDG缓冲液中孵育验尸AD和非痴呆的对照急性脑切片，在室温下将15μMMX04稀释到15μmMx04之前，然后将切片在羧基NMDG中洗涤3次，每次将切片洗涤5分钟。在室温下，将灰质的活检（直径为2 mm）在冷冻保护剂（5％w/v蔗糖和20％w/v葡萄糖40,000）中孵育30分钟。然后，A型标本载体（Leica，目录号16770152）的100μm深孔中充满了冷冻保护剂，并将组织活检仔细放置在里面，以避免组织损伤。然后使用Leica Em Ice覆盖它们B型B型B型B型B型B型（Leica，CatalogNo。16770153）和HPF（在-188°C时大约2,000 bar）覆盖。 　　使用低温荧光显微镜（Leica em Thunder）对HPF样品进行成像，该显微镜在-180°C下，使用HC PL APO×50/0.9 Na Cryo-Objective，Orca Flash 4.0 V2 SCMOS摄像头（Hamamatsu Photonics）和太阳能光发动机（Lumencor）。DAPI滤光片集（激发和带宽365和50，Dichroic 400；发射和带宽，460和50）用于检测MX04标记的淀粉样蛋白。Rhodamine滤光片集（激发和带宽546和10，Dichroic 560；发射和带宽，525和50）用作对照成像通道。这些图像的尺寸为2,048×2,048像素。以17％的激光强度为0.1 s，获得了HPF载体的瓷砖扫描。以30％的强度和0.2 s的曝光时间获得了超薄的冷冻截面的Z堆栈。使用Fiji ImageJ处理图像。 　　将HPF样品载体转移到配备有修剪的（Trim 20，T399）和Cemovis（DiAtome，Cryo Immuno，Catalog，Catalogno。MT12859）钻石刀的冷冻 - 淡拉球体（Leica EM FC7，-160°C）中。修剪了一个测量100×100×60μm的组织的梯形固醇，其中包含靶淀粉样蛋白。然后，用钻石刀（硅石刀（硅藻），冷冻免疫，目录号MT12859）在-160°C下切开冷冻截面（70 nm厚），并粘附在发光上（Cressington Glow闪光出现）（60 S，1×10-4 Mbar，15 MA）3.5 MA）3.5 MA）3.5/1 1，300 MICERSENT）量枪支和金睫毛微型手持。 　　通过MX04荧光（激发370 nm，发射460-500 nm），通过低温荧光显微镜评估淀粉样蛋白斑块在组织冷冻剖面中的位置。选择了显示MX04信号的网格正方形进行冷冻。冷冻FM图像与电子显微照片之间的对齐方式是使用MATLAB SCRIPT67,68进行的，其中将围绕感兴趣区域的碳箔中的十个孔中的中心用作信托标记物来对齐冷冻-FM和Cryo-Em图像。 　　将含有用于冷冻FIB-SEM升降机的HPF样品的载体转移到配备有Trim 45 T1865钻石刀的冷冻 - 淡拉球体（Leica EM FC7，-160°C）中。修剪载体和HPF组织的表面以去除表面冰污染和颤动的损害组织的顶层69。为了实现这一目标，将三个300μm宽的台阶修剪回载体的四个侧面：将最外层的步骤修剪约30μm，然后修剪大约20μm，然后将最内向的步骤缩小，大约将其修剪为10μm。然后将所得的组织突出的平方缩小大约2–5μm，以使其更平滑的污染表面较少，用于冷冻纤维-SEM和拔出。 　　冷冻-CLEM工作流程在配备有Quorum Cryo-System，Zeiss Cryo-Accessories工具Kit和Omniprobe 350 Cryo-Micromaneripulator（Oxford Instruments）的Zeiss Crossbeam 550纤维扫描电子显微镜上进行。对于Cryo-FM，使用了配备了飞机扫描和Linkam Cryo阶段的直立轴成像台的Zeiss LSM（激光扫描显微镜）900。 　　在法定人数桌上，将HPF样品载体（Leica Microsystems）安装在相应的Zeiss通用样品持有器（USH，Zeiss Cryo-Accessories工具套件）上。首先，将Zeiss USH放置在用于执行冷冻FM的Linkam冷冻阶段的Zeiss适配器上。使用Zeiss转移盒将组件在液氮中转移到Linkam Cryo阶段。使用Zen Blue V.3.6软件（Zeiss显微镜）的插件Zen Connect获得了LM Zen Connect项目。用×5，0.2 Na C- ePiplan apochromat空气物镜获得样品和持有人的图像，具有403。MX04，反射（用于与EM图像相关），并与385、511和567 NM LED成像（与EM图像相关）和对照通道，并组合46 NM LED（iftiation Band Band Band Band 38 38）。±19 nm，bp 555±15 nm，bp 631±16.5 nm，发射QBP 425±15 nm，514±15 nm，592±12.5 nm和709±50 nm）。获取图像的框架尺寸为2.79×2.10 mm和1,936×1,460像素；MX04，反射和控制的5％和60％的LED LED功率和50、6和300毫秒的曝光时间。 　　为了进行样本质量评估，将大型3D体积（1.27×1.27×0.108 mm，2,824×2,824像素，49 Z片）用10×，0.4 Na C-Eppiplan pohlomat pochromat Apolomat Air Object扫描。MX04（0.04％激光功率，405 nm激光器，检测窗口410–546 nm，像素居时间为0.74 µs）和反射（0.01％激光功率，640 nm激光器，检测窗口630-700 nm，Pixel dell Time 0.74 µS）。 　　使用100×，0.75 Na LD EC ECIPLAN-NEOFLUAR空气目标（125.15×125.15×19.8 µm和1,140×1,140像素，37 Z切片，37 Z切片，37 Z切片，Pixel Dell Time 1.8 µs），具有以下设置：MX04 las las las laser lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase lase las lase lase lase las lase lase las lase，410–544 nm）和反射（0.05％激光功率，640 nm，检测窗口639–700 nm）。使用Zeiss LSM Plus插件在所有共聚焦图像（10×和100×）上运行线性反卷积。 　　使用Airyscan 2检测器和上面详细介绍的×100物镜从感兴趣的区域获取Airyscan Z堆栈。使用405 nm激光系（1.5％激光功率，405 nm激光，像素固定时间2.18 µs，检测窗口400–650 nm，图像尺寸62.31×62.31×13.65 µm和946×946 Z Slies）检测到MX04。使用Zeiss Zen Blue软件的Airyscan关节反卷积（JDCV）插件处理Airyscan图像。用Zeiss Zen Blue制备的最大共聚焦和Airyscan图像Z堆栈进行冷冻-Clem对齐。最终确定光学显微镜后，将连接到Linkam适配器连接的USH转移到Quorum Prep框中。USH与Linkam适配器分离，并安装在Zeiss Cryo提出样品支架上，USH以平坦的定位为准，并固定的半月式全核网格被夹在自动驾驶中（Thermo Fisher）。使用法定级别的冷冻刀，将样品持有人转移到连接到Crossbeam 550 Fib-Sem上的Quorum Prep室中。主和预备室中的冷冻阶段和抗抗激素的温度分别设置为-160°C和-180°C。将样品与铂溅射45 s（5 mA电流）。溅射涂层后，将样品转移在主腔室中的群体冷冻阶段。 　　进行了冷冻-FM靶向的冷冻FIB-SEM升降机，在Zen Connect Imaging项目中驱动Zeiss Crossbeam Fib-Sem阶段，其中使用表面特征（Cryoplaning标记和冰污染）作为信托标记70（扩展数据图11），使用表面特征（Cryoplaning标记和冰污染）将冷冻-FM，SEM和FIB图像相关联。在正常视图（0°阶段倾斜），5毫米的工作距离和2.3 kV加速度电压下，获得了HPF载体的概述和缩放的SEM图像，并加载到现有的Zen Connect Project（Imageter参数SE2，Everhart-Thornley）detector，98 PA SEM当前时间，98 PA SEM，4,096×3,072 PIXS的新的SEM会话中迭代和800和420 nm像素大小。通过使用反射模式频道图像进行对齐，将SEM会话与已经获得的Cryo-FM会话相关。 　　由于在FIB模式下需要图像导航，因此阶段被倾斜至54°，允许正常的FIB视图。将样品带入SEM和FIB的巧合点，具有5 mm的工作距离和概述FIB图像（成像50 PA，SE2检测器，2,048×1,536、1,6 µS居住时间，像素平均时间，300 nm Pixel Size），以与以前的SEM/CRYO-FM SEMISTING MINGEMINT。巧合点被细细地调整为瞄准的区域，并根据冷冻-FM和FIB图像之间的比对，将用于粗横截面的铣削框定位。使用30 Na Fib探头，将大约80μm的宽度，35毫米高和30μm深的梯形横截面从前侧铣削。当观察到冰污染，尤其是在感兴趣区域的顶部时，样品持有人被转移回Quorum Prep盒进行清洁。在低温条件下，通过使用刷子和使用拭子擦拭样品表面。在法定人数准备室中的另一个溅射涂层之后（有关参数，请参见上文），将铂前体的冷沉积施加在横梁主腔室中。对于冷沉积，样品和气体注入毛细管之间的距离约为3 mm，并且开放气体储层阀45 s。气体储层温度约为28°C（未加热的气体储层状态）。使用保存的阶段位置，针对感兴趣区域的横截面，检查了巧合点的比对。使用已经铣削的横截面作为参考，拍摄FIB图像并与以前的FIB会话对齐。 　　接下来，使用30 Na FIB探头从背面进行第二个相应的横截面和大约60μm宽的左侧切割，该切口剩下的大约80μm宽，10μmThick，30μm深30μm深的纸巾块附着在其右侧。在正面，使用15 Na FIB探头进一步抛光了横截面。将阶段倾斜至10°倾斜，用于铣削大约80μm宽的L形底切，在左侧留下一个小连接（7 Na Fib探头）。作为提出工具，将大约5 µm厚的铜块连接到了杂型机械手尖端上。该阶段在10°倾斜下，允许微观手持量绕过自动环。提出之前，使用铜材料的重新充电铣削（三个2.5×5μm铣削窗户，带有700 PA FIB探头和140 MC CM-2剂量），将大约5μm的铜块连接到组织块的右侧。接下来，将组织块从左侧切开以实现拔出。在10°阶段的倾斜下，大约80μm宽的块通过重新充电铣削到半月式EM网格（全磷脂）中，将其夹在自动格里德中并切成两半，使远端约40μm块附着在EM电网上。剩余的近端约有40μm附着在杂型机上的块，附着在EM网格上的第二个位置上。在两个8–10μm宽之前，将阶段倾斜至56°，在每个块的一半中铣削了大约15μm深的薄片窗户。在56°阶段倾斜下，组织块和/或网格平面和纤维束之间的角度为2°，可以绕过外部自动格环以使薄片变薄。将薄片从两侧依次稀释至大约2 µm，然后大约1μm，然后分别使用700、300、100和50 PA FIB探头，大约1μm，然后大约500 nm，最后130至200 nm。每个Lamella窗口都在左侧，右侧和底部都用不填充的组织框起来。 　　使用Thermo Fisher 300 Kev Titan Krios G2，X型福特，配备Falcon4i探测器和Selectris Energy Filter在利兹大学的Astbury Biostructure实验室中进行了冷冻电子层析成像。使用TOMO5.15（Thermo Fisher）实施了剂量对称倾斜方案71，以100μm的物镜孔和5–6.5μm的散焦以2°的增量收集倾斜序列，从-60°到 +60°。每个倾斜度增量以每倾剂的大约2 e −/Å2的约2.3 s的暴露（分数为8帧），总剂量约为每倾斜的总剂量约为120 e-/Å2，像素大小为2.38Å。 　　在AD样品中，选择位置以三种不同的方式收集倾斜系列：（1）MX04荧光的存在，（扩展数据图3A），（2）与融合淀粉样细丝相似的密集丝状结构的出现在中等放大的区域中（图3B）和（3B）的特征（3B）和其他构图，该区域的特征是MMX04荧光效率或其他构图或其他效率。在中等放大的显微照片中（补充表1、2和4）。对照非AD样品缺乏MX04信号（扩展数据图2a，b）和媒体放大显微照片中的丝状结构。因此，在介质放大显微照片的可见膜隔室的区域中选择了倾斜序列位置（补充表3）。 　　我们以前通过CryoEt30报道了AppNL-G-F小鼠模型中Aβ-Plaques的结构。与6小时PMI和Freeze-Thaw步骤的验尸组织相比，AppNL-G-F组织在NMDG Buffer56中被心脏灌注56，没有冻结，并且PMI30短得多（以下称为AppNL-G-F-F-H-HPF样品）。为了控制6 h PMI的影响和冻结步骤对组织的分子结构，我们准备了AppNL-G-F小鼠（C57B/L6背景）组织在类似于验尸add供体组织的条件下，用于冷冻的组织，该组织具有6 H PMI和Freeze-thaw步骤（Wereon topnlll-G-f-f-f-f-f-pmi-f-pmi-fef-pmi-ft-splese）。根据《英国动物科学程序法》（1986年）和美国国立卫生研究院指南对动物进行治疗。利兹大学动物福利和道德审查委员会提供了监督和批准，并由英国政府家庭办公室许可。 　　为了准备Appnl-g-f-pmi-ft-HPF，在Culling30前24小时24小时，一只10个月大的雄性AppNL-G-F小鼠接受了5 mg kg-1 mx04的腹膜内注射。将尸体在室温下持续6小时，以模仿在收集前脑之前的验尸延迟，并在液氮中闪烁。接下来，前脑是通过在冰冷的NMDG缓冲液中进行急性切片制剂的大约5分钟的急性切片制剂，包括大约5分钟的呼吸阶段，在冰冷的NMDG缓冲液中，将前脑（图1C）带走，在羧基的NMDG缓冲液中孵育1 H，用15 µm MX04，3×5分钟的碳水化合物和30分钟的buffers Inmed and abobers Inmed and-abobers Inboxy inm abober Inub inm abobers inm abobers and abobers and carboxy and a carbasy and a nmd carbasty and a carbosy and a。在高压冻结之前，在室温下，冷冻保护剂（5％w/v蔗糖和20％w/v葡萄糖40,000）在室温下。MX04标记的β-淀粉样斑块位于HPF组织中，通过冷冻FM，收集了大约70 nm厚的冷冻切片并附着在EM网格上。通过冷冻-FM成像组织切片，以定位MX04标记的β-淀粉样木质斑块，然后分别从14和46个位置收集层析成像倾斜序列，分别有和没有MX04冷冻-CLEM。这些断层图的数据收集参数和成分在可补充7中详细介绍。 　　所有MX04标记的β-淀粉样菌斑断层图（60个中的14个）来自AppNL-g-f-f-pmi-ft-HPF低温型，包含排列在平行捆绑包或网格的β-淀粉样纤维纤维（扩展数据图5）。这种原纤维结构与以前报道的AppNL-G-F-HPF斑块没有区别，该斑块直接直接是HPF，而没有6 h PMI和Freeze-Thaw step30（扩展数据图5）。 　　接下来，我们比较了AppNL-G-F-PMI-I-ft-HPF中包围淀粉样蛋白斑块的组织的非淀粉样蛋白斑块和细胞隔室的非淀粉样蛋白组成部分，而不是先前发布的AppNL-g-f-f-f-hpf30。（1）与AppNL-G-F-HPF pograms30相比，AppNL-G-F-PMI-ft-HPF pomkograms中不存在微管。这是可以预期的，因为微管在寒冷温度下或核苷酸三磷酸盐源损害时会迅速解散72,73。在验尸AD和非痴呆供体断层图中也没有微管。（2）与AppNL-G-F-HPF相反，AppNL-G-F-PMI-FF-HPF pomgram图包含线粒体的子集，cristae肿胀和耗尽的线粒体基质（扩展数据图6C，D，D和补充表7）。该结构表示坏死和/或凋亡呼吸道塌陷74,75。同样受损的线粒体在验尸AD和非痴呆的供体断层图中也观察到（扩展数据图6A，B和补充表7）。（3）与AppNL-G-F-HPF相反，60个AppNL-g-f-f-f-pmi-ft-HPF断层图中有2个包含膜片段，这表明PMI和/或Freeze-Thaw步骤可能会在含有淀粉样蛋白丝的脑组织中产生膜片段。在88个验尸AD断层图中，也有10个爆发质膜，但在64个非抑制术后术后断层图中不存在。（4）与AppNL-G-F-HPF相比，60个AppNL-G-F-F-PMI-FFMI-FFMF PMF断层图中有10个包含爆发质膜，这表明PMI和Freeze-Thaw步骤可以破坏这些小鼠中的膜完整性（扩展数据图5）。在80个死后AD断层图中，有11个观察到爆发的质膜，但在64个非痴呆的对照后断层图中不存在。 　　最初以每组图的基础进行亚纤维和tau细丝的亚图对齐和平均，以评估淀粉样蛋白结构与其亚细胞上下文之间的关系。由于组织内淀粉样蛋白的密集结构，仅具有轴向的横线图（以重建断层图的Z轴为导向）原纤维和细丝提供了足够的对比度，以准确选择亚VOLUMES以进行亚图图平均。 　　将剂量分级的视频帧进口到经线（v1.1.0b）76中，以进行框架对齐和CTF的初始估计。倾斜系列堆栈是在经线中生成的，并进口到Etomo IMOD（v.4.12.35）77,78中，用于使用贴片跟踪进行细胞对齐。进口之前，将质量较低的对齐帧排除在堆栈一代中。然后将细胞对齐的倾斜序列进口到经线中，并以9.52Å的像素大小重建了3D-CTF校正的断层图（BIN4）。有关tau细丝和Aβ原纤维的细节，请参见补充表5和6。 　　对于tau细丝，对9个冷冻体积（来自冷冻段的7个，有两个来自升降层）进行了亚图平均。在3Dmod（IMOD v.4.12.35）中，手动从4×binned（9.52Å的体素尺寸）中挑选了55至278个tau丝（24×100×24箱尺寸）。每个灯丝的坐标表示为两点轮廓，其各自位于每个细丝的电线杆上的“头”和“尾部”模型点。3DMOD的切片机函数用于旋转和翻译每个Tau细丝，以确保沿细丝轴近似不同的模型。将这些模型文件作为输入，以默认模式运行电子断层扫描（PEET）“ Stalkinit”命令的粒子估计的脚本，以生成新的单点模型文件（包含头部，质心和尾巴的坐标），初始动力列表和旋转轴文件，以供应和旋转轴，以提供对准和平均PEET（V.1.1.1.1.1.1.17.17.1.1.1.17,1.1.17.17 a）79,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7.1.1.1.1.17,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7na nya。为了最大程度地减少与缺失的楔形的对齐，并验证模型点坐标的准确性，通过限制从Nevo参考文献轴心的质心进行旋转和翻译搜索来产生初始平均值。在随后的PEET比对迭代中，使用更新的质心坐标和方向作为输入进行旋转和翻译搜索。如果观察到可见的MAP分辨率改进，则运行CreateAletignedModel，以生成新的模型，动机列表和旋转轴，这些轴包含对齐方式的更新位置和粒子的方向。在子体积比对期间，将具有模糊边缘的圆柱掩模应用于Stalkinit参考体积。在不应用对称性或螺旋重建方法的情况下生成了Stalkinit子图平均值。每个断层图中Tau细丝的螺旋扭曲是通过Peet Stalkinit平均测量的。 　　为了进一步改善对齐方式，使用“ AddModpts”命令沿Stalkinit灯丝轴（99,664个新的模型坐标）添加每1个素模型（99,664个新的模型坐标）。AddModpts模型被用作用于子体积比对的新输入和PEET中的平均。CreateAlignedModel还以添加模型对齐方式进行运行，输出了新的型号以及更新的位置和粒子方向的初始动机列表。 　　在PEET中进行初始对齐后，将坐标和方向导入到4.059 v.4.059（torelionCoords）中，以进一步细化Warp Bin4断层扫描重建59。这是使用“ iModinfo”命令的“ -l”选项来实现的，将模型信息输出到文本文件中。使用自定义Python脚本（可从github获得https://github.com/jjenkins01/model2helicalpriors.git）生成螺旋先验信息，以修改star文件以包含rlnhelicalialicaltubeID，rlnhelicaltracklengeTrackLength，rlnangletilt to 0）rlnanglepsiflipratio（设置为0.5）。This modified STAR file (generated from ‘toRelionCoords’ and custom python scripts) was used in Warp to generate subtomograms (24 × 24 × 24 box size, 9.52 Å) that were then extracted for helical 3D auto-refinement and classification in RELION (using helical twist estimated from PEET stalkInit averages and without C2 symmetry).然后，以4.76Å（48×48×48个盒子尺寸）的像素大小重新提取精制的子图解图，然后进行螺旋3D自动再填充和分类。螺旋3D自动再填充和3D分类的最后一轮对在2.38Å（96×96×96）的像素大小的翘曲中进行了重新提取。最终的平均值通过依赖后处理进行锐化，并且在两个独立完善的半映射之间估计FSC的全球地图分辨率为0.143。将粒子坐标和从关系3D自动再填充的粒子坐标和方向取向，该分辨率达到了亚纳米测定分辨率（图3H），以用于M（V.1.0.9）81进行多颗粒改进。 　　对于Aβ原纤维，使用来自MX04标记的β-酰胺斑块收集的两个冷冻截面体积进行了亚图平均，这些块包含轴向取向的原纤维。如tau细丝所述，遵循相同的手动采摘和亚图平均程序（使用Stalkinit）。最初，从一个断层图中挑选了100架原纤维，其原纤维为两点“头”和“尾巴”模型，位于每个原纤维的另一端。该模型被用作PEET“ Stalkinit”命令的输入，以生成新的模型文件（头，质心，尾巴），初始动机列表和旋转轴文件，用于对齐和平均PEET。100个原纤维的亚图平均图产生了一个无特征，平滑的管，并通过用于平均的原纤维数量增加了细节，这可能是粒子异质性的可能指示（扩展数据图10）。为了评估原纤维异质性，在IMOD中手动测量了单个原纤维的宽度。根据平均原纤维宽度，挑选了三个原纤维亚群（3-5 nm原丝样杆，4-9 nm纤维和6-12 nm宽的纤维）。像以前一样，用PEET进行了20个原丝样杆，42个原纤维和42个宽的原纤维的亚图平均图（补充表6和扩展数据图10）。 　　为了比较原位亚图平均图的结构相似性与过体纯化的tau构象体，可用的Ad tau细丝原子模型（PDB 5O3L和5O3T）被安装成半映射，并将EM放置v.1.2.237,38 v.1.2.237,38在Chimerax v.1.582,83 v.1.582,83提供了fit（FIFS）。9和补充表5）。运行EM放置时，将MAP分辨率设置为使用0.143 Half-Map FSC阈值确定的值。单粒子冷冻EM数据的理论和经验表明，LLG评分为60或更高，表明非随机拟合，对于更准确的模型和更高的分辨率MAPS38，观察到更高的值。LLG分数与该模型解释了地图的信息内容有关。由于该模型所涵盖的地图部分的总信息内容既取决于其本地（包括各向异性）分辨率及其音量，因此可以通过MAP质量与模型尺寸和质量的任何组合来达到高于阈值的LLG分数。置信阈值本身（LLG 60）不会随着地图的分辨率或优先方向引起的问题而变化38。作为参考，将PHF Atomic Model24拟合到3Å分辨率的单粒子冷冻EM（扩展数据图1G）半映射中得出LLG 11,889，相关系数为0.66。原子模型（PHF或SF）24与亚图平均地图傅立叶壳相关性还与苯金v.1.17.0a65计算，避免了通过限制与中央球的比较的平均地图边缘的伪像，该比较的中央球体的半径为80Å（扩展数据图13）。 　　通过使用Artiax v.0.4.4.784可视化Chimerax中的Euler角，评估了最初的亚图平均（在PEET中没有螺旋对称性）和关联中的螺旋平均值。向细丝分配了极性方向，其中大于或等于80％z euler角的人沿相同的方向定向（扩展数据图12C – F）。 　　所有断层扫描片均是由4×binned（9.52ÅVoxel尺寸）层析成像重建制备的一个素厚，该重建由MotionCorr2 v.1.2.160与Aretomo v.1.3.085重建的对齐框架生成，并与Isonet V.0.0.286进行了反v.1.3.085。使用手动表面建模工具在Dynamo V.1.1.53287中进行了断层图内的分割膜。包含断层膜模型的坐标信息的发电机表被转换为CMM文件，并在Chimerax中可视化。EMAN2 v.2.9988中的基于神经网络的断层图分割管道用于分割Tau丝和Aβ原纤维。在图3C – H中，使用IMOD橡皮筋工具和Trimvol命令修剪了包含β-淀粉样纤维和Tau丝的原始断层造影量的区域。然后，使用SEGGER工具在Chimerax中可视化原始的断层造影密度，以通过连通性为每个Aβ原纤维/Tau细丝着色。 　　在补充表1、2、3和4分别详细介绍了来自β-淀粉样斑块，tau病理学，非痴呆的控制和冷冻纤维-SEM升降的组织冷冻剖面的层学量组成部分。成分最初由两个策展人独立确定。接下来，两个策展人合并并验证了每个注释。层造影量体积的细胞内和细胞外区域的边界是由髓鞘轴突的存在或封闭每个断层扫描量内细胞内细胞器的脂质双层确定的，以及用于冷冻-CLEM的相应电子显微照片。鉴定出以下成分：（1）根据MX04冷冻-CLEM标记和杆状分配淀粉样蛋白原纤维或细丝：纤维和细丝的缺失，因为它们在断层造影量中缺乏从非痴呆的控制脑捐献者中重建的层析成绩；（2）与细胞外空间（不包括淀粉样蛋白原纤维）相比，由含有膜结合的细胞器的质膜定义的亚细胞隔室，与细胞外空间相比，细胞细胞质量较高的蛋白质浓度是一致的；（3）线粒体，由双膜定义，包括外膜和内部线粒体Cristae；（4）假定的F1FO-ATP酶在内部线粒体膜中可识别（例如，见图2C）；（5）与其他线粒体相比，线粒体肿胀的线粒体受损，双膜结合的隔室和密度较少的线粒体基质，而线粒体的一部分似乎是空的（扩展数据图6）；（6）髓鞘的轴突，定义为五个或更多的层6-8 nm膜脂质双层，封闭了亚细胞隔室89；（7）开放的膜片，由大约5 nm厚的膜脂质双层板定义，在没有形成封闭隔间的间隙空间中；（8）爆裂室， 在断层图的X -Y平面上打开的膜室；（9）将细胞外囊泡定义为封闭并位于细胞外空间的膜；（10）C形囊泡被定义为囊泡管腔内的杯状膜；（11）多层体定义为40–250 nm囊泡或亚细胞室，包裹在三个或更多的同心环为4.5–6 nm膜脂质双层中；（12）位于细胞外部位置的细胞外液滴，无定形和光滑球形液滴35,36；（13）位于细胞外部位置的细胞外立方体颗粒，27-200 nm直径的颗粒（这些颗粒包含较高层析成像密度的横纹层：相距2.5–2.8 nm，扩展数据图7）；（14）囊泡被定义为封闭的球形膜；（15）F-肌动蛋白被定义为大约7 nm直径的细丝，由球状亚基90的螺旋排列组成（仅在AD和非痴呆的对照供体断层造影量的次要子集中观察到F-肌动蛋白）；（16）核糖体：球形25–30 nm直径密度颗粒；（17）微管，25 nm直径的管，带有13个微管蛋白亚基和（18）刀损伤，组织冷冻截面包含样品似乎压缩的区域，有时将裂缝留在组织中，这些裂缝在组织中很容易识别为孔中的孔。 　　所有冷冻-CLEM（图1G和4B以及扩展数据图3A，B和11），断层片切片图像（图1H，2A，2A，B，3和4E，F和扩展数据图3C – E，4、7和8A）和电子图（图4D和扩展数据AD。β-淀粉样菌斑冷冻截面，25个TAU病理截面，13个TAU病理学拔出片状片状图，请参见补充表1、2和4）和非痴呆的对照（64个冷冻段Tomograms，补充表3，表3）。所有免疫组织化学成像（图1A和扩展数据图1A），免疫印迹（图1B和扩展数据图1B），免疫荧光（图1C和扩展数据图2A）和冷冻-FM成像（图1E，F和4C，F和4C数据和扩展数据图2B）的实验是这些代表的3.4是这些代表性的研究者。扩展数据图中的层析成像切片。6和7是HPF的冷冻数据集（23个冷冻截面，n = 2个生物学重复）30和冷冻解冻（60个冷冻截面断层图，n = 1个生物学重复，请参见补充表7）AppNL-G-f-f-f敲击小鼠。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。