HeLa S3细胞是从HelmholtzZentrumFürInfektionsforschung，Braunschweig获得的，并对支原体进行了阴性。细胞未经认证。HeLa nuclear extracts were prepared according to a previously published method27 and were dialysed twice for 2.5 h against 50 volumes of Roeder D buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.9, 0.2 mM EDTA, pH 8.0, 1.5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 10% (v/v) glycerol, 0.5 mM DTT and 0.5 mM PMSF).对于Pre-B和B样复合物，将10 nm M7G（5'）PPP（5'）G型Minx外显子RNA在其3'End7处含有3个MS2 APTAMER的MINX外显子RNA与100 nm MS2-MBP融合蛋白预孵育40分钟，然后再在冰上加入冰反应。在剪接缓冲液（1.5 mM MGCL2，65 mM KCl，20 mM HEPES-KOH pH 7.9、2 mm ATP和20 mm ATP和20 mM肌酸磷酸盐）中，用50％（V/V）核提取物在30°C下进行剪接反应。对于前B复合物，进行剪接20分钟。为了获得B样复合物，在允许前B复合物形成后，增加了100倍的摩尔超过5's oligo（5'-AAG / guaaguau-3'，其中 /指示外显子 - 源边界），并在30°C下再孵育10分钟。然后在冰上冷却剪接反应10分钟，在18,000克处离心15分钟以去除聚集体并加载到MBP陷阱HP柱（GE Healthcare）上。用G-75缓冲液（20毫米Hepes-KOH pH 7.9、1.5 mM MGCL2和75 mM NaCl洗涤该色谱柱），并用含有15 mm麦芽糖的G-75缓冲液洗脱配合物。将洗脱的复合物加载到线性10–30％（v/v）的甘油梯度中，以G-75缓冲液制备，以17,500 r.p.m.离心。在TST41.14转子（Thermo Fisher Scientific）的4°C下在4°C下进行18小时，并从梯度的底部收集分数。峰梯度分数中的复合物的RNA在变性4–12％的Nupage凝胶（生命技术）上分离，并通过用SYBR Gold（Thermo Fisher Scientific）染色来可视化。对于冷冻EM分析，洗脱的复合物进行梯度固定 （grafix）28，并如下所述进一步处理。 　　如上所述，CE PE-B复合物被MS2亲和纯化。为了获得前B5'SSS络合物，随后将亲和纯化的复合物在0°C或30°C下孵育10分钟，单独使用100倍的摩尔超过5'SS Oligo。为了生成前B5'SS+ATP/ATPγS复合物，在0°C下与5'SS寡核孵育后，在添加2 mM ATP或ATPγS后，将复合物在30°C下于30°C孵育30分钟。To generate pre-B5′ssLNG+ATPγS complexes, purified pre-B complexes were incubated with a 100-fold molar excess of an elongated 5′ss oligo (5′-AAG/GUAAGUAUCGUUCCAA-3′) for 10 min at 0 °C, followed by the addition of 2 mM ATPγS and incubation for an additional 30 min at 30 °C.为了获得BATP或BAMPPNP前复合物，将亲和纯化的前B复合物分别与2 mM ATP或AMPPNP一起在30°C下孵育30分钟。然后将所有复合物加载到线性10–30％（v/v）甘油梯度中，在G-75缓冲液中制备，并如上所述进行离心和分析。对于冷冻EM分析，洗脱的配合物进行梯度固定（Grafix），并如下所述进行进一步处理。 　　For western blot analysis of purified pre-B, pre-B5′ss, pre-B5′ss+ATP and pre-BATP complexes, 200 fmoles of each complex was separated on 4–12% NuPAGE gels and transferred to a Hybond P membrane. Membranes were first blocked with 5% milk in 1× TBS-T buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.1% Tween 20) and then incubated with rabbit antibodies against human phospho-PRP6 (1:1,000 dilution) and phospho-PRP31 (1:500 dilution), followed by antibodies against human SF3B1 (1:700 dilution), PRP31 (1:500 dilution) and PRP6 (1:1,000 dilution; AB99292, Abcam). Subsequent to incubation with the primary antibodies, membranes were washed with TBS-T buffer and incubated with HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:30,000 dilution; 111-035-144, Jackson Immunoresearch). After washing, membranes were immunostained using an enhanced chemiluminescence detection kit (GE Healthcare) and the signal was visualized using an Amersham Imager 680. 　　如上所述，CE PE-B复合物被MS2亲和力纯化，并通过以下修饰进行：在亲和力纯化后，将洗脱的复合物与400μMBS3在18°C的总体积为1.4 mL的情况下与400μmBS3交联45分钟。将交联的复合物加载到线性10–30％（v/v）甘油梯度上，并在17,500 r.p.m上进行离心。在TST41.14转子中2°C下的18小时。在S100-AT4转子（Thermo Fisher Scientific）中汇总了含有二聚体前B络合物的四个峰值分数。将颗粒的，交联的二聚体CE Pre-B复合物（约20 pmol）溶解在50 mM碳酸氢铵缓冲液中，含有4 M尿素，用二硫代氨酸酯降低，用碘乙酰胺烷基化，并在尿素中稀释至1 m，稀释至1 m，并用胰蛋白酶内溶液消化。使用SEP-PAK VAC TC18 1CC墨盒（Waters）提取肽，冻干并随后溶解在40 µL 2％乙腈（ACN）和20 mM氢氧化铵中。在Xbridge C18 3.5 µM 1×150 mm逆时相（Waters）上分离肽，使用45分钟的10 mm氢氧化铵在45分钟内以60 µL min – 1的流速在45分钟内在45分钟内ACN分离。收集一分钟的60 µL馏分，在12分钟内汇总（总共12个汇总分数），真空干燥并溶解在5％ACN和0.1％三氟乙酸（TFA）中，以进行随后进行的UHPLC-ESMMS/MS分析，以在ORBITIFIC上进行了三次complicate complicatific confercificate unplc-esi – si-ms/ms。将质谱仪耦合到带有定制35 cm C18柱的Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统（Thermo Scientific）（内径为75 µm，内径为75 µm，带有reprosil-Pur 120 C18-AQ珠，3 µm孔径（Maisch Dr. Maisch））。MS1和MS2决议分别设置为120,000和30,000。仅选择具有3-8个电荷状态的前体用于MS2。使用Thermo Scientific Xcalibur（V.4.4.16.14）软件获取MS数据。 　　B-like complexes were MS2 affinity-purified as described above with the following modifications: after affinity purification, eluted spliceosomal complexes were crosslinked with 350 μM BS3 for 30 min at 18 °C in a total volume of 2 ml. Crosslinked complexes were loaded onto a linear 10–30% (v/v) glycerol gradient and subjected to centrifugation at 21,000 r.p.m. for 12 h at 2 °C in a TST41.14 rotor. Peak fractions containing dimeric B-like complexes (about 12 pmol) were pooled, pelleted, digested and the peptides were reverse-extracted as described above for the pre-B complexes. Peptides were fractionated by gel filtration using a Superdex Peptide PC3.2/30 column (GE Healthcare) in 30% ACN and 0.1% TFA. Fifty-microlitre fractions corresponding to an elution volume of 1.2–1.8 ml were analysed in duplicate on a Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer coupled to Ultimate 3000 uHPLC (Thermo Scientific). MS data acquisition was performed using Thermo Scientific Xcalibur (v.4.5.445.18) software. 　　The protein composition of the spliceosomal complexes was determined in a search with MaxQuant (v.2.4.2.0) against a UniProt human reference proteome using the same samples but before pre-fractionation by either offline reverse phase (pre-B) or size exclusion (B-like) chromatography. Based on the MaxQuant results, restricted protein databases were compiled and used for protein–protein crosslink identification by searching the Thermo raw files with pLink (v.2.3.11) for pre-B and pLink (v.2.3.9) for B-like complexes29. For model building, a maximum distance of 30 Å between the Cα atoms of the crosslinked lysine residues was allowed. 　　For cryo-EM samples, spliceosomal complexes were loaded onto a linear 10–30% (v/v) glycerol gradient prepared in G-75 buffer containing 0–0.1% glutaraldehyde (GRAFIX) and centrifuged at 17,500 r.p.m. for 18 h at 4 °C in a TST41.14 rotor. Fractions were collected from the bottom of the gradient and were quenched with 120 mM Tris-HCl pH 7.5 on ice. Complexes in the peak gradient fractions were pooled, buffer-exchanged and concentrated in an Amicon 50 kDa cut-off unit. Complexes were then adsorbed for 20 min to a thin layer carbon film that was subsequently attached to R2/2 UltrAuFoil grids (Quantifoil). A volume of 3.8 μl of double-distilled water was applied to the grids and excess water was blotted away using a FEI Vitrobot loaded with pre-wet filter paper, with the following settings: blotting force of 11 and blotting time of 7.5 s at 4 °C and 100% humidity. Samples were subsequently vitrified by plunging into liquid ethane cooled to liquid nitrogen temperature. Cryo-EM grids of the pre-B, pre-B5′ss, pre-B5′ss+ATPγS, pre-B5′ssLNG+ATPγS and pre-BATP were imaged in a Titan Krios 1 (Thermo Fisher Scientific), equipped with a Cs corrector, operated at 300 kV, on a Falcon III detector in linear mode at a calibrated pixel size of 1.16 Å at the specimen level (see Extended Data Table 1 for a summary of EM statistics). Cryo-EM grids of B-like and pre-BAMPPNP were imaged in a Titan Krios 3 (Thermo Fisher Scientific), operated at 300 kV, on a Falcon III detector in linear mode at a calibrated pixel size of 1.35 Å at the specimen level. Krios1 and Krios3 cryo-EM images were acquired using Thermo Fisher EPU2.1 with an exposure time of 1.02 s (40 movie frames), with a total dose of 60 e– Å–2 and 48 e– Å–2, respectively. 　　对于所有冷冻EM数据集，使用MotionCor（V.2.0）30对齐，剂量加权并汇总框架。使用GCTF31估算了散焦值。使用Cryolo32进行粒子拾取。对于每个样品，从30-50个显微照片手动挑选了大约800–1,000个颗粒，并用于训练神经网络模型，然后将其用于自动为相应的数据集选择颗粒。除非另有说明，否则使用RISION 3.1（http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/main_page）进行所有后续处理。冷冻EM数据被随机分为两半，以进行金标准的FSC测定3.1。 　　对于前B复合物，从25,904个显微照片中挑选了777,350个颗粒，并提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为3.48Å）。在无参考的二维（2D）分类之后，保留了586,198个颗粒以进行进一步处理，从中使用100,000个颗粒在CryoSparc33中从头开始重建。从头算模型显示了3D结构类似于CI前B复合物的结构，但具有额外的模糊密度（后来证明是第二个原型）。使用Chimera34擦除了模糊密度以及不稳定的U2密度，并且所得的3D结构低通滤波至40Å分辨率以防止模型偏置，然后在Relion 3.1中用于3D分类。586,198个颗粒分为5个类，其中包含2种主要类型的颗粒。在第1类中，两个原始物都定义明确，而在第2类中，只有一个明确定义的前B型原子剂。为了改善前B型原子剂的分辨率，将两个原始物分别重新提取，使用160×160像素的盒子（3×binned，像素大小为3.48Å），使用对准第一轮3D分类的对齐参数。然后将所得颗粒分别分别分类，并将良好颗粒组合并进行掩盖的3D分类，重点是Tri-SnRNP密度。然后以480×480的盒子重新提取显示出明确定义的TRI-SNRNP密度的279,781个颗粒。在两轮比赛中进行了3D改进，CTF精致和贝叶斯抛光。在3D改进的最后一轮中，围绕Tri-SnRNP核心的柔软面膜 - 配合PRP8NTD，PRP8大域（PRP8LARGE），U4/U6词干I和Stem I和stem III和Stem III，U5 SnRNA，u5 snu114，snu114，sad1，sad1，sad1，dim1，dim1PRP28 N末端结构域（PRP28NTD）和BRR2 N末端结构域（BRR2NTD）以及BRR2区域 （涵盖BRR2解旋酶结构域和PRP8JAB1），分别在标称分辨率为3.5Å和4.2Å的情况下产生了两个3D重建。应用无对准的集中分类来改善U4核心区域（包括U4 SM域，SNU66，U4/U6词干I和STEM III和STEM III，RBM42，RBM42，PRP8RH和PRP8EN）和U2区域（包括U2 5'域（包含U2 5'域），将U2构成SF3B蛋白，U2/U2/U2/U6 ls ls u6 ls和U6 ls。掩盖精致后，U4核心和U2区域分别分别为标称分辨率为6.1Å和12Å。 　　对于B样复合物，从14,665个显微照片中挑选，提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为4.05Å）的488,598个颗粒。无参考的2D分类后，总共保留了389,830个颗粒，从中使用100,000个颗粒在CryoSparc33中进行了从头算重建。从头算模型显示出二聚体结构。使用Chimera34擦除了定义较不明确的原始物，并且定义较好的原始物被低通滤波至40Å，并用作整个数据集的3D分类的起始模型。在第一轮3D分类中，应用了一个杂种周围的软面膜，因此所有颗粒都被迫仅与一个杂种对齐。这种分离的颗粒与不良颗粒具有至少一个定义明确的原始物。为了研究良好的颗粒是否包含单体B样复合物，在第一个3D分类之后，将颗粒进一步分为三个没有掩模。所有3D类均显示出明确定义的二聚体复合物，这表明所有良好的颗粒都是二聚体B样复合物。为了改善B样原型的分辨率，将颗粒重新以480×480像素盒的原始像素大小重新添加并重新提取。进行了两轮改进，CTF精致和贝叶斯抛光。In the final round of 3D refinement, soft masks around the tri-snRNP core (encompassing PRP8, the 5′ss oligo, U4/U6 stem I and stem II, U5 snRNA, PRP3, SNU114, SAD1, DIM1, PRP6NTD, SF3A1CT, PRP28NTD, SNU13, FBP21, SNU23, MFAP1 andPRP38A），BRR2区域（包含BRR2解旋酶结构域和PRP8JAB1）和U4/U6区域（包含U4/U4/U6 stem I和STEM I和STEM II和STEM II，SNU13，PRP3，PRP4，PRP31，PRP31，PPIH，PPIH，PPIH，PRP6HAT和PRP8RH），用于3. reconitions，用于3d reconitions reconitions i reconitions。分别为4.3Å和3.3Å。应用无线的集中分类以改善U2区域 （包括U2 5'区域，U2/U6螺旋II和SMU1）。掩盖细化后，将U2区域提高到约12Å分辨率。 　　对于前B5'SS络合物，从23,372个显微照片中挑选，提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为3.48Å）的1,283,541个颗粒。总体而言，在无参考的2D分类后保留了944,381个颗粒，并使用Pre-B络合物的低通滤波的TRI-SNRNP或B-like复合物的Tri-SNRNP核心进行3D分类（不包括BRR2区域）作为起始模型。两种启动模型都产生了相同的结果，其中一个3D类包含定义明确的杂物。即使将B样复合物的Tri-SNRNP核心用作起始模型，也没有发现类似于B样复合物的类。为了将1类和2类二聚体分开，良好的3D类进一步分为九类。为了改善前B5'SS毒素的分辨率，在480×480像素盒中以原始像素尺寸重新中心并重新提取颗粒，并在三个三d分类中使用三轮掩码进行三轮3D分类。选择了好课，并进行了3D精制，然后进行了一轮CTF精炼和贝叶斯抛光。最终的176,879个颗粒在Tri-SnRNP核心周围（包含5'Ss Oligo，prp8ntd，prp8ntd，prp8large，u4/u4/u4/u4/u4/u4/u4 stem i和stem i和stem i and iii and prp8ntd，U5 snrna，u5 snrna，u5 snrna，snu114，snu114，sad1，sad1，dim1，dim1，prp6ntd and prp28nt and prrr28nt and prrr28nt and prrr28nt and prrr28nt and）标称分辨率为4.2Å的重建。 　　对于前B5'SS+ATPγS复合物，挑选，提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为3.48Å）。由于CryoSparc的从头算重建在很大程度上类似于B样复合物，因此B样复合物的Tri-SnRNP核（不包括BRR2）被低通滤波至40Å，并用作3D分类的起始模型。在480×480像素盒中，将良好的类组合在一起，重新中心和重新提取，以原始像素大小重新提取。进行了两轮3D细化，CTF细化和贝叶斯抛光，并在Tri-SnRNP核心周围用柔软的面膜（包含PRP8、5'SS oligo，U4/U4/U4/U4/U4/U4/U4/U4/U5 snrna，u5 snrna，u5 snrna，u5 snrna，u5 snu11，s s snu11，s dim1，s dim1，s dim1 dim1，PRP28NTD和SNU13），以标称分辨率为3.1Å的3D重建。将集中的分类不排列，然后进行掩盖的精炼，以改善BRR2区域（涵盖BRR2旋转酶结构域，PRP8EN和PRP8JAB1），以提高标称分辨率为4.0Å。 　　对于前B5'SSLNG+ATPγS复合物，从13,740个显微照片中挑选，提取并纳入了200×200像素（3×binned，像素大小为3.48Å）的541,230个颗粒。将前B5'SS+ATPγS复合物的低通滤波的TRI-SNRNP核心作为起始模型，将粒子分类为3D，并且最佳类别的粒子被重新中心并以480×480像素盒中的原始像素大小重新添加并重新提取。经过两轮3D细化，CTF细化和贝叶斯抛光，最后136,333个颗粒在TRI-SNRNP核心周围用柔软的面膜（包含PRP8，Long 5'ss oligo，U4/U4/U4/U4/U4/U4/U4/U4/u6 stem i和stem ii，u5 snrna，u5 snrna，u5 snrna，u5 snu11，s s s s s s dim1，s dim1，dim11 cot11 cot 3 cons。PRP28NTD和SNU13），以标称分辨率为3.7Å。 　　对于BATP前复合物，从11,752个显微照片中挑选，提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为3.48Å）。2D分类后，总共保留了499,792个颗粒。测试了各种启动模型的3D分类，包括PRE-B，PER-B5'SS和PER-B5'SS+ATPγS复合物的TRI-SNRNP核心。从所有启动模型中删除了BRR2的密度，以防止模型偏置，并且从前B5'SS+ATPγS复合物中的低通滤波的TRI-SNRNP核心最适合3D分类。即使将两个复合物用作起始模型，也没有检测到类似于B或前B5'S的类。最佳3D类（94,460个颗粒）的颗粒进一步分为3D，分辨率为30Å，这表明25.4％的颗粒包含良好的第二个原始物质。其余的（74.6％）的颗粒显示出较差的第二个原始物，这是由于第二次原始物的柔韧性或在第二个原始物中缺乏稳定的TRI-SNRNP整合（即，它是由CE A样复合物组成）。鉴于所有94,460个颗粒均包含至少一个好的原始物，对于3D重建高分辨率核心，所有这些颗粒均以480×480像素盒的原始像素大小重新中心并以原始像素大小重新提取。经过两轮3D的精致，CTF的细化和贝叶斯抛光，最后3D改进是在Tri-SnRNP核心周围柔软的面膜进行（包括PRP8，Minx Exon RNA的5'SS区域PRP28NTD和SNU13），以标称分辨率为3.7Å。随后围绕Tri-SnRNP核心的局部3D分类没有揭示进一步的结构异质性，这表明Tri-SNRNP核心无论存在稳定的第二个原始物体，而无需稳定的第二个核心。 　　对于BAMPPNP前复合物，从20,337个显微照片中挑选，提取并归纳为200×200像素（3×binned，像素大小为4.05Å）的619,945个颗粒。2D分类后，总共保留了371,919个颗粒。为BATP复合物准备的相同组合模型用于BAMPPNP复合物的3D分类，而Pre-B复合物的低通滤波Tri-SNRNP核心最佳。即使将其用作起始模型，也没有检测到类似于B5'SS+ATPγS的类。最佳3D类中的粒子以480×480像素盒子的原始像素大小重新置换并以原始像素大小重新提取。在一轮3D改进，CTF改进和贝叶斯抛光之后，最终的53,422个颗粒在Tri-SnRNP核心周围用柔软的面膜（包含PRP8NTD，prp8ntd，prp8large，u4/u4/u4/u4/u6 stem i和stem i和stem i iii和stem iii，u5 snu snrna，u5 snu114，u5 snu114，sad11，dim1，dim1，di di di di di di di di di di di di di di di di di d di di di d di nts and。BRR2NTD），以标称分辨率为4.1Å的3D重建产生3D重建。将集中的分类不带对齐，然后将掩盖的精炼应用于提高PRP28/U1 SNRNP区域（包含PRP8，U5 SNRNA，PRP28和U1 SNRNP），以提高标称分辨率为6.1Å。 　　模型构建是通过将冷冻EM，晶体和Alphafold2结构扩展到EM密度并在COOT35中进行调整来进行的。补充表3中提供了建模蛋白和RNA成分及其相应的模型模板的列表。简而言之，CE PRE-B复合物是通过拟合Tri-SNRNP和CI Pre-B复合物的TRI-SNRNP和U2 SNRNP部分进行建模的，该部分是将其建模的部分。U2部分（包括SF3B核心复合物，SF3A核心复合物，U2 SM，U2-A'和U2-B''）被截断到多酰胺链，而无需进一步调整。SF3B6蛋白是根据其位置相对于A-like复合物（PDB 7Q4O）中的SF3B1 C末热域进行建模的，而无需进一步调整，与交联一致（补充表2和扩展数据图2）。对于高分辨率的TRI-SNRNP部分，在COOT中手动调整了每个组件及其侧链。通过将B复合物模型（PDB 8Q7N）拟合到EM密度中，对B样复合物进行建模，并从模型中删除了B样中不存在的部分（即UBL5，扩展的U6/5'SS螺旋，TCERG1和BUD31）。从头开始建模了5's寡核的两个副本，并在COOT中手动调整了高分辨率的TRI-SNRNP部分。通过将CE PRE-B复合物的各个组件拟合到EM密度为刚体，对B5'SS的复合物进行建模。PRP8以及5's oligo 1是从B样复合物中取走的，并作为刚体的物体适合EM密度。由于相对较低的分辨率，将侧链最初截断为多酰胺链，并在COOT中手动调节碳骨架。然后在本地分辨率允许的位置手动添加侧链。前B5'SS+ATPγS） 通过将B样复合物的各个组件拟合到EM密度中来建模。高分辨率的Tri-SnRNP部分在COOT中调整。将BRR2解旋酶（PDB 4F91）的晶体结构截断为多酰链链，并以刚体为刚体。未进一步调整BRR2CC，并将N末端盒式盒子手动调节到COOT中的密度。SF3A1的C末端部分（氨基酸496–521）由Alphafold2预测，并扩展到密度并在COOT中进行调整。U6/5'SS螺旋和U4/U6茎III（核苷酸35-39）之间的U6核苷酸，U4/U6茎I和Stem III（核苷酸63-74）之间的U4核苷酸在COOT中模拟了。通过将前B5'SS+ATPγS络合物拟合到EM密度中，对B5'SSLNG+ATPγS复合物进行建模，并删除柔性U4 SNRNA链（核苷酸62-85）。U4 SM核作为刚体的密度拟合到密度中。扩展的U6/5'SS螺旋被建模为A形螺旋并拟合到密度。通过将前B5'SS+ATPγS复合物拟合到EM密度，并将5'SS寡核序列拟合到MINX外显子序列中，对BATP复合物进行建模。将Minx外显子的A -4和C -5从头开始模型为COOT中的EM密度。由于在相应位置没有EM密度，因此删除了PRP28 RECA结构域。通过将CE PRE-B复合物拟合到EM密度中，对BAMPPNP络合物进行了建模。U1 SM核，U1 snRNA和U1-70K取自CI Pre-B复合物（PDB 6QX9），并以刚体为刚体的物体停靠在EM密度中。PRP28的闭合RECA结构域以及未知的单链RNA根据与AMP-PNP和单链RNA（PDB 3I5X）结合的闭合MSS116P死盒解旋酶的晶体结构进行建模。使用phenix36在实际空间中精炼了各种配合物的三个部分的三个部分的坐标。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。