使用了以下化学物质和试剂：Dounce均匀均匀的均质（DWK Life Sciences，885302-0002）；Pierce抗HA磁珠（Thermo Scientific，88837）;Pierce抗晶状磁琼脂糖（Thermo Scientific，A36797）；抗FLAG M2磁珠（Sigma Millipore，M8823）;Pierce蛋白A/G磁珠（Thermo Scientific，88802）；Igepal CA-630（Sigma-Aldrich，i8896）;S-trap微柱（Protifi，C02-Micro-80）;碳酸氢盐三乙基铵（TEAB）缓冲液（Sigma-Aldrich，T7408）;十二烷基硫酸钠（SDS; Bio-Rad，1610302）;DSSO（Thermo Scientific，A33545）;DHSO（CF Plus Chemicals，PCL042）;DMTMM（Sigma-Aldrich，74104）;N-二烷基β-麦尔替剂（DDM，金生物技术，DDM5）;Nativemark蛋白标准（Invitrogen，LC0725）;天然份4–6％凝胶（Invitrogen，BN1002Box）;多屏过滤板（Sigma Millipore，MSHVN4510）;TMTPRO 16PLEX集（Thermo Fisher Scientific，A44520）;蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，4906845001）;Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP；金生物技术，51805-45-9）;2-氯乙酰胺（Sigma-Aldrich，C0267）;S-甲基硫甲磺酸盐（MMTS; Sigma-Aldrich，208795）;胰蛋白酶（Promega，v511c）;Lys-C（Wako Chemicals，129-02541）;羟胺溶液（Sigma-Aldrich，438227）;Sep-Pak C18和C8 50毫克墨盒（Waters，WAT054955和WAT054965）;高ph反相肽分级试剂盒（Thermo Scientific，84868）;Bio-Rad蛋白质测定染料（Bio-Rad，5000006）;3- [4-（2-羟基乙基）-1-二哌嗪]丙酸丙酸（Thermo Scientific，J61296AE）；Empore Spe Discs C18（Sigma Millipore，66883-U）;Gateway LR Clonase II酶混合物（Thermo Scientific，11791020）;Nebnext Ultra II Q5 Master Mix（新英格兰Biolabs，M0544L）;CAS9-NLS（加利福尼亚大学伯克利分校的QB3 MacRolab）；克隆器（Stemcell Technologies，05889）;Miseq Reagent Nano Kit V2（300个周期； Illumina，MS-103-1001）;Geneart Precision GRNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，A29377）;rnaeasy Qiagen试剂盒（Qiagen，74104）;24孔玻璃底板（Cellvis， P24-1.5H-N）;康宁方培养菜（康宁，431110）；Nunc Nunclon Delta细胞培养皿（Thermo Scientific，140675，150318和168381）;Corning Matrigel矩阵（Corning，354230）;DMEM与F-12（Gibco，11330057）;Neurobasal培养基（Thermo Scientific，21103049）;非必需氨基酸（Gibco，11140050）;Glutamax（Gibco，35050061）;N-2补充剂（Gibco，17502048）;Neurotrophin-3（NT3; Peprotech，450-03）;脑衍生的神经营养因子（BDNF; Peprotech，450-02）;B27（Gibco，17504001）;Y27632二氢氯化物（岩石抑制剂； Peprotech，1293823）;Cultrex 3D培养基质层粘连蛋白I（R＆D Systems，3446-005-01）;Accutase（Stemcell Technologies，07922）;FGF2-G3（内部）；人类胰岛素（Santa Cruz Biotechnologies，SC-360248）;转化生长因子-β（Peprotech，100-21）；Holo-Transferrin人类（Sigma-Aldrich，T0665）;碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，S5761-500G）;亚硒酸钠（Sigma-Aldrich，S5261-10G）;强力霉素（Clontech Labs，631311）;Ultrapure 0.5 M EDTA（Invitrogen，15575020）;16％多聚甲醛（电子显微镜科学，15710年）；DMEM（Gibco，11995073）;胎牛血清（Cytiva，SH30910.03）;氢化可的松（Sigma-Aldrich，H0135）;聚乙基亚胺（Polysciences，23966）;Fugene（Promega，E2311）。 　　The following primary antibodies were used (1:1,000 for immunoblotting, 1:400 for immunofluorescence): Flag (Sigma-Aldrich, F1804), HA (Cell Signaling Technology, 3724), V5 (Invitrogen, 14-6796-82), TMEM230 (Origene, TA504888), LAMP1 (Cell Signaling Technology, D2D11), RAB5(Cell Signaling Technology, C8B1), CLR (ProteinTech, 10292-1-AP), golgin 97 (ProteinTech, 12640-1-AP), VDAC1 (ProteinTech, 55259-1-AP), CLCN3 (Cell Signaling Technology, 13359S), GFP (Thermo Scientific, a10262), mCh (Thermo Scientific, M11217),EEA1（细胞信号技术，C45B10）。使用以下二级抗体（免疫印迹1：10,000，免疫荧光1：400）：抗兔免疫球蛋白G（IgG）马萝卜过氧化物酶（HRP）结合物（Bio-Rad，1706515）；抗小鼠IgG HRP结合物（Bio-Rad，1706516）;山羊抗鸡皮IGY（H+L），Alexa Fluor 488（Thermo Scientific，A-111039）；山羊抗鼠IgG（H+L）交叉吸附，Alexa Fluor 555（Thermo Scientific，A-21434）；山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附，Alexa Fluor 647（Thermo Scientific，A-21244）。 　　如前所述，质粒进行了61。使用Gateway Technology（Thermo Fisher Scientific）或Gibson Assembly（New England Biolabs）将人类Orfeome Collection（版本8版）的入口克隆克隆到相应的质粒中。通过基因合成（Twist Bioscience）获得了完整的TMEM230（Y29C/R78L/X121W）突变体。对于慢病毒转导，使用噬菌体和plenti骨架。为了转染，使用了PCG和PCDNA3.1骨架。生成以下质粒：PGCS-3×FLAG-ATP11B（ADDGENE，225511），PCDNA-TMEM30A-V5（Addgene，225510），PGCS-3×HA-TMEM230（Addgene，225512），PGCS-3×HA-TMEM230（Y29C/x.29c/ry29c/r7888888888888888888889）225513），plenti-ubc-ha-tmem230（Addgene，225516），plenti-ubc-ha-tmem230（r78l）（Addgene，225517），plenti-ubc-ubc-ha-tmem230（x121W）（x121W）225520），plenti-ubc-ha-tmem230（x121pg）（Addgene，225518），plenti-ubc-Ha-tmem230（y29c/r78l/x121w）（Addgene 2255521）（Addgene，225507），PCDNA-TMEM9B-3×HA（Addgene，225509），PCDNA-TMEM9-3×HA（Addgene，225508），Phage-MCH-CLCN3（Addgene，225514），Phage-TMEM9-EGFP（AddgeNe）（Addgene，2255555515）。以下质粒用于慢病毒包装：PPAX2（Addgene，12259），PMD2（Addgene，12260）。 　　将HEK293细胞（ATCC； RRID：CVCL_0045）培养在10 cm的菜肴中，含有10％胎牛血清的高葡萄糖和丙酮酸DMEM。对于CO-IP实验，使用聚乙基胺（25 kDa）以6μg质粒在2：1的比例下以60％的质粒（25 kDa）转染细胞，并在37°C和5％CO2下孵育48小时。SUM159PT细胞（来自T. Walter的礼物，纪念Sloan Kettering; RRID：CVCL_5423）在DMEM中培养6孔培养皿（每孔300,000个细胞），并用谷氨酰胺补充的F-12中培养了5％的胎牛血清，1μgMl-1 Hydortis and-1 sundol-nind-1 insul-nind-1inindun-1 insul-11 insul-f-12。1天后，使用Fugene和Optimem转染试剂将细胞用500 ng的质粒转染，并在37°C和5％CO2下孵育。转染后一天，用呼毒素选择细胞，并将其镀成24孔玻璃底培养皿（每孔50,000–100,000个细胞）。 　　如先前所述62,63，对基因编辑的人类胚胎（ES）细胞（H9，Wicell Institute）进行了培养。用E8培养基在涂有Matrigel的板上维持细胞，并在DPBS中用0.5 mM EDTA分裂。ATCC执行质量测试，以确保使用短串联重复分析对HEK293T细胞系进行身份验证。通过Wicell使用G波段核分型和短串联重复分析，通过Wicell对H9 ES细胞（来自Wicell）进行身份验证。通过核分型证实了基因编辑的H9人ES细胞。HEK293，SUM159T和H9细胞系每月使用支原体加上PCR分析试剂盒（Agilent 302107）测试了支原体。本研究中H9细胞的使用已由胚胎干细胞研究监督委员会（批准编号00051）批准。 　　如前所述65，具有AAVS1-TRE3G-NGN2驱动程序的人体ES细胞被区分为无神经元。简而言之，将干细胞以2×105个细胞ML-1（分化第0天）（在ND1培养基中（DMEM）（dmem含F-12，N-2，N-2，人10 ng ml-1 bdnf，10 ng ml-1 huml nt3，非符号氨基酸），非符号氨基酸，0.2μgml-1 huml-1 huml-1 huml-1 dox and conY27632（岩石抑制剂）。第二天，介质与没有Y27632的ND1交换。第二天，将培养基替换为ND2（Neurobasal培养基，B27，Glutamax，10 ng ml -1 bdnf，10 ng ml -1 nt3），并补充了2μgml -1多西环素。直到实验日（第19-21天），每隔一天，将有50％的培养基用新鲜ND2取代。在第4-6天，以每孔4×105的细胞以4×105的细胞进行了测试。从第10天开始，强力霉素从ND2中删除。 　　如先前所述的62,66,67，慢病毒载体被包装在HEK293T细胞中（ATCC数CRL-3216; RRID：CVCL_0045）。使用聚乙基亚胺以4：2：1的比例与PPAX2，PMD2和靶向载体的60％汇合一起将细胞转染。第二天将培养基更改为ND2，并在转染后2天收集。过滤含有慢病毒的ND2培养基（0.22μm），用于分化天第11-12天的无神经元。 　　使用CRISPR-CAS9（参考文献68）对人类ES细胞（H9 AAVS1-TRE3G-NGN2 3×FLAG-EEA1; RRID：CVCL_D1KV）进行了基因编辑。用NEON转染系统用0.6μg引导RNA和3μgCas9-NLS（QB3 Macrolab，加利福尼亚大学QB3 Macrolab，QB3 Macrolab，QB3 Macrolab）的混合物进行电穿孔，如先前根据参考资料的特定方案所述。70。为了生成TMEM230x121W变体纯合子的人ES细胞，电穿孔中包括单链DNA寡核苷酸（5'-CTACCGTGGTTACTCCTATGATGACATCACTTGATGATGACCCCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCACCCCCCCCCCCCAGGAGGAGGAGGAGGAGTCAGTGGAACTGTCCCAGCCCAGCTTAAGATAGATAGAGAAGAAACAGAAACATATATATACTATATACTATATATATAGCTG-3'）。将细胞在低O2孵化器中回收24-48小时，并用Sony Biotechnology（SH800S）细胞分系师（RRID：SCR_018066）分类为单个细胞。通过使用Illumina Miseq System（RRID：SCR_016379）测序来验证单个克隆的基因编辑，并通过免疫印迹和/或MS验证。使用Geneart精确GRNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）为序列生成指南RNA：TMEM230 - / - 5'-CCTGAAGGTCAAGGTCAATGTCAATGTAAGCCATCGT-3'，TMEM230x121W 5'-CTCCTCCTCTCCTCCTCCTCCTATGGGGGGTGGGGGT-3'，TM9'，TM9 - '，TM9 -5'-tatctttggtggtgtgtgtgtc-3'，tmem9b - / - 5'-tctacatCaggCCCCCCGCCGCAC-3'。此处报告的ES细胞将根据要求提供，但需要Wicell的重大转移一致。 　　对于免疫荧光染色，SUM159PT细胞用PBS中的4％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5％Triton X-100在PBS中透化10分钟。在室温下，用0.1％Triton X-100在PBS中用3％BSA阻断细胞。将细胞与原代抗体（1：200稀释）在3％BSA中在4°C下为0.1％Triton X-100的PBS中孵育3％。洗涤后，将细胞与Alexa荧光二抗（1：400）在4°C下孵育1小时，并用Hoechst 33342（1：10,000）染色5分钟。将细胞洗涤并维持在PBS中，直到显微镜分析。根据参考方案进行免疫染色。71。 　　使用尼如何CSU-X1旋转盘共焦在尼康Eclipse Ti-e机动显微镜上旋转盘共焦，并计划倍率100×1.45 n.a油对象镜头对细胞进行成像。用Tokai Hit Stage Top孵化器在37°C，5％CO2和95％的湿度中进行活细胞成像。使用Hamamatsu-Fusion BT CMOS摄像机（6.5μm2光电二极管，16位）和NIS元素图像采集软件（RRID：SCR_002776）获取图像。在相同的曝光时间和激光功率下测量所有样品。使用最大强度投影图像和最大熵阈值，使用ImageJ/Fiji（RRID：SCR_002285）的JACOP插件（RRID：SCR_025164）进行共定位分析。在LME4 R软件包中实现了线性混合效应模型统计，并具有嵌套设计，以说明从同一培养物中获得的图像良好和相同的生物学重复。图中指示了三个独立生物学重复的每个独立生物学重复的视野数（图4E，F）。 　　进行评分方法以定义内体蛋白质组，并为每种蛋白质分配无偏分的分数，以反映基于实验数据位于内体中的概率。对文献进行了研究，用于捕获哺乳动物生物中内体蛋白质组的研究，从而产生16个数据集18,19,73,74,75,75,76,77,78,79,79,80,81,82（补充表1）。排除了不完整的数据集或模棱两可的细胞器净化（例如，“囊泡”或混合细胞器）。更新了过时的Uniprot ID和过时的基因名称（Uniprot 2022-02）。Ensembl和BiomArt R软件包（RRID：SCR_019214）用于检索并匹配啮齿动物基因与其人类直系同源物，包括当多个基因匹配时所有人类基因。随后的分析基于跨数据集的蛋白质识别作为评分方法的度量（补充表1）。为了评估评分指标和数据集的性能，从已发布的literature1,3,22,56,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113,114,115,116 (Extended Data图1A）。通过使用Factominer R软件包（RRID：SCR_014602；扩展数据图1B），通过多个通信分析可视化数据集概述。对各种细胞器位置的蛋白质注释是基于先前的研究62（扩展数据图1C）。内体评分的另一个指标是从内体颗粒的无标签蛋白质组学分析获得的内体蛋白质丰度，如下所述（扩展数据图1D和补充表1）。与内体蛋白相互作用的数量是从Bioplex 3.0（RRID：SCR_016144），StringDB和Corum（28.11.2022 Corum 4.1释放）中获得的28,117,118，以获取上述知名内体蛋白的参考列表。对于StringDB， 仅包括与实验证据或高分（组合得分> 0.7）的数据库的物理互动。 　　每个度量标准对内体蛋白进行分类的性能（从上述参考列表中）通过接收器的操作特征曲线，使用带有二项式逻辑回归为预测变量的Proc R软件包来评估（图1B）。组合内体评分是通过总和三个单独指标获得的。根据参考列表，将蛋白质视为内体的部分区域和将蛋白质视为内体的阈值是10％的假阳性。评分方法导致407种预测的内体蛋白（排除了Mitocarta3.0中存在的14种蛋白（RRID：SCR_018165））与众所周知的内体蛋白的参考列表合并为522个蛋白质（补充表1）。这些蛋白质使用Bioplex 3.0（参考文献28），Opencell（RRID：SCR_021870）119进行表征，并从Uniprot检索出出版物（扩展数据图1E – G）。所有后续分析的内体注释均基于此列表。 　　如先前所述，用HEK293EL细胞进行了内托-IPS进行。120。从五个24.5 cm平方培养培养皿中收集表达FLAG-EEA1的HEK293EL细胞（参考文献19），以进行共馏分实验（n = 3），每次复制（分为两批）进行交联实验（n = 2）（n = 2）。如先前所述44,121。每次重复的三种15厘米培养皿用于无神经元的实验（n = 3）。将细胞在4°C下以1,000g的含量为1,000g，并用KPBS缓冲液（100 mM磷酸钾，25 mM KCL和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，pH 7.2）洗涤一次。将细胞颗粒重悬于KPB中，并在带有25笔笔触的Dounce均质器中裂解。将样品在4°C下以1,000g的1,000克离心5分钟，并通过Bradford分析对PNS蛋白浓度进行量化。将样品与70μl抗Flag Sigma磁珠在4°C下孵育50分钟，以进行无脱神经元实验，1.6 ml Sigma抗lag lag sigma磁珠进行共缩分化实验和20 ml的每批抗粉状磁珠，用于交叉粉的抗flag Pierce磁珠。使用KPB的磁性支架将珠子洗涤四次。对于定量蛋白质组学，将内体用120 µL 0.5％NP40（Igepal）在KBPS中在4°C下持续30分钟，并在-80°C下储存直至MS样品制备。为了进行共同分级和交联实验，在4°C下用0.8 mm 3×FLAG肽在45分钟内用0.8 mm 3×FLAG肽洗脱了内体（扩展数据图1H）。将肽洗脱的样品在Posi-click Tubes中以10,000克离心20分钟（Denville，C2170）。用KPB将内体颗粒洗涤两次，以去除多余的3×标志肽并立即加工。对交联实验的第二次复制进行了额外的洗涤，这有助于增加MS分析中的覆盖范围。 　　该分析的协议可在Ref上获得。122。从HEK293细胞的10厘米培养皿中的蛋白质或每次复制的15厘米盘（n = 2或4）的15厘米盘在4°C下以25 mm HEPES pH 7.4、150 mm NaCl和蛋白酶抑制剂鸡肉鸡肉鸡肉鸡肉鸡肉鸡肉cock123在4°C下萃取1小时。将样品以20,000克离心20分钟，并将上清液与15μl抗HA磁珠（Pierce）或25 µL抗lag磁珠（Sigma）一起孵育，根据蛋白质标签在4°C下持续2 h。对于使用内源性抗体的IP，将上清液与5μg抗体在与15μl磁性A/G珠孵育之前孵育过夜。将珠子用磁性支架分离，并用洗涤缓冲液（0.1％DDM，25 mm HEPES，150 mm NaCl，NaCl，pH 7.4）洗涤四次。用30μl1.5×Laemmli缓冲液洗脱与珠子结合的蛋白质，用于免疫印迹或30μl1.5×S-trap裂解缓冲液（7.5％SDS，150 mM TEAB pH 8.5），用于MS分析，并在80°C下加热5分钟。 　　将与Laemmli缓冲液混合的样品在80°C下孵育5分钟，并在标准TGX无染色预制凝胶中加载，以进行后续免疫印迹。电泳后，使用Bio-Rad Chemidoc成像仪（Bio-RAD）扫描凝胶，并将电转移到PVDF膜上在10 V上过夜。用5％的非脂肪牛奶将膜封闭，并在4°C中与原代抗体一起在4°C中孵育2 hrp-Conibibed hrp-conibibed for hrp-conibed for hrp-consy cers for hrp-consy cers for hrp-cons for hrp-cody s for hrp-cody s for hrp s for hrp s for hrp cys for hrp s for hrp c。洗涤后，使用SuperSignal West Pico加化学发光底物（Thermo Fisher，目录编号34580），在Bio-Rad Chemidoc成像仪中获取印迹图像。使用Bio-Rad Image Lab软件（版本6.1.0; RRID：SCR_014210）处理图像。使用无污渍的总蛋白质量将负载差异归一化。该过程的协议可在参考文献中获得。124。所有凝胶和印迹的完整版本都可以在图1中获得。 　　有关此过程的详细协议，请参见参考。125。来自三个独立生物内部IP重复的蛋白质复合物进行分级和处理，如前所述126。将新鲜准备的纯化的内体颗粒重悬于40μlkpbs中，用0.5％DDM重悬，并在旋转的4°C下提取蛋白质45分钟。通过在20,000g下离心，并与10μlBn的加载缓冲液，1μLCoomassieG-250混合和0.5μl天然分子量标记物阐明蛋白质提取物。在150 V的4–16％天然凝胶上以1.5 h和250 v在4°C下的250 V上运行样品。将凝胶固定在50％乙醇和3％磷酸中，然后用Coomassie染色。将每个样品切成48 1毫米切片，并转移到96孔滤板中以进行内凝胶消化123。简而言之，用100 µL 5 mM TCEP在50 mM碳酸氢铵中降低蛋白质，在37°C下30分钟。在50毫米碳酸氢铵中，用20 mM氯乙酰胺烷基烷基在室温下15分钟。馏分在37°C下用0.2μgLys-C进行了散布，干燥和消化4小时，然后与0.2μg胰蛋白酶孵育过夜。提取肽，在SpeedVac中干燥，并在5％的acegronitrile（ACN）中重构，5％甲酸用于数据非依赖性采集（DIA）液相色谱法（LC）–MS/MS分析。 　　有关两个交联过程的详细协议，请参见参考。127. Freshly prepared purified endosomal pellets from two independent biological replicates were resuspended in 300 μl KPBS and immediately crosslinked by incubating with 1 mM DSSO (disuccinimidyl sulfoxide, with the full chemical name bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3,3′-sulfinyldipropionate, bis-(propionic acid NHS酯） - 硫化氧化物，室温下40分钟（参考文献6）。在室温下用50 mM Tris缓冲液7.5用50 mM Tris缓冲液淬灭反应，持续30分钟。将交联的样品在8 m尿素中变性，在37°C下用5 mm二硫苏糖醇降低30分钟，并在室温下用40毫米氯乙酰酰胺烷基化30分钟。用Lys-C（1:75）在37°C的一夜之间用Lys-C（1:75）消化交联蛋白。将样品尿素浓度用50 mM 3- [4-（2-羟基乙基）-1-二哌嗪]丙二硫酸稀释至2 m，并在37°C下与胰蛋白酶（1：100）孵育6小时。用50 mg C8 sep-pak固相萃取柱脱盐，并通过强阳离子交换色谱法干燥并分离。A 70-min linear gradient of mobile phase (0.5 M NaCl in 20% ACN, 0.05% formic acid) was used from 0 to 8% in 14 min, to 20% at 28 min, to 40% at 48 min and to 90% at 68 min at a column flow rate of 0.18 ml min−1 in a PolyLC PolySulfoethyl A column (3 μm particle size, 2.1 mm inner diameter and 100 mm length).每30秒钟从35分钟开始收集分数，持续10分钟，然后每分钟收集。将分数在SpeedVac中干燥，并使用C8 Stagetip脱盐。在5％ACN，5％甲酸中重构每个样品的大约30个部分，并通过LC -MS/MS分析。 　　重悬于300μlkpbs中，将新鲜纯化的内体颗粒重悬于另一个独立的生物学复制品，并在37°C下与8 mm DHSO和16 mM DMTMM孵育90分钟，立即通过孵育90分钟（参考32）进行交联。将交联样品在5％SDS中变性，并短暂超声，在55°C下用5 mM二硫代硫醇降低5分钟，并用20 mM MMTS烷基化。通过制造商提供的S-trap Mini-Spin柱消化方案进行交联的蛋白质（见下文）。如上所述，将肽脱盐并通过强阳离子交换色谱分离。通过LC -MS/MS分析了总共30个部分。 　　PNS样品的三个独立重复（根据实验的不同）和内部IP样品与水量相等的水混合并进行样品制备。按照制造商（Protifi，C02-Micro-80）提供的S-trap微型自旋柱消化方案（4.7版），128,129,130​​。简而言之，将每个样品与2×裂解缓冲液相等的体积（10％SDS，100 mM TeaB缓冲液pH 8.5）混合。直接在1.5×裂解缓冲液中直接收集了来自非神经元（n = 2或4）的蛋白质IP样品。通过在55°C下与5 mM TCEP孵育30分钟，并在室温下用40 mm氯乙酰胺孵育30分钟，从而降低蛋白质。将样品用磷酸酸酸，并与洗涤缓冲液混合（90％甲醇，100 mM TeaB缓冲液pH 7.55）。将样品转移到微型自旋柱中，并通过离心用150 µL洗涤缓冲液洗涤4次。将蛋白质用0.5 µg lys-C在37°C的潮湿室中消化过夜，然后用0.5μg胰蛋白酶孵育6 h。通过三个随后的离心步骤（分别具有50 mM TEAB缓冲液，0.2％甲酸和50％ACN）从色谱柱中收集肽，并在SpeedVac中干燥。 　　肽标记的协议可在参考文献中获得。131。将肽重悬于50μL（PNS样品）或35μl（Endo-IP样品）100 mM茶具缓冲液pH 8.5中。通过添加11μL或7μLACN标记PNS和内部IP肽，并在室温下用10μL或8μLTMTPRO试剂（ACN中的20 mg mL-1库存）在室温下孵育1小时。通过在10μL5％羟胺持续15分钟中加入反应。 　　对于PNS样品，将每个样品的相等肽量组合在一起，并用100 mg C18 sep-pak固相萃取柱脱水，并通过基本的pH反相高性能高性能LC分离。使用Agilent 300延伸C18列（3.5μm粒径，2.1 mm的内径和250 mm的长度），使用10 mM碳酸氢铵pH 8的50分钟线性梯度从5％到35％ACN进行色谱。如先前所述，将最初的96个分数合并为24个分数132。将一组12个非粘合分数在SpeedVac中干燥，并使用C18 Stagetip脱盐。将干肽在5％ACN，5％甲酸中重构，并进行LC -MS/MS分析。 　　对于Endo-IP样品，根据制造商的协议，将每个样品的相等肽量组合在一起，并使用高PH相反的肽分级试剂盒（Pierce）进行分馏。使用C18 Stagetip将洗脱液组合成六个部分，干燥和脱盐。将干肽在5％ACN，5％甲酸中重构，并进行LC -MS/MS分析。 　　对于蛋白质IP样品，使用C18 Stagetip将每个样品的相等肽量组合，干燥和脱水，而无需进一步分馏。将干肽在5％ACN，5％甲酸中重构，并进行LC -MS/MS分析。 　　使用与Faims Pro（参考文献131）的Orbitrap Eclipse Tribid质谱仪（RRID：SCR_020559）相连的征服NEO UHPLC系统（RRID：SCR_020559）（参考文献131）。将肽在100μm的微毛细管柱上分离，该柱装有20厘米的ACCUCORE C18树脂（2.6μm，150Å）。90分钟的线性梯度在80分钟内从5％到20％的ACN，在83分钟时为36％，在0.125％甲酸中，在85分钟时为98％，在0.3 µl min-1中使用。在Orbitrap上获得了MS1光谱（分辨率60,000，扫描范围350–1,350 m/z，标准自动增益控制（AGC）目标，自动最大注入时间）。通过高能碰撞解离（HCD）以36％的标准化碰撞能量来实现肽片段化。在Orbitrap上获取MS2光谱（分辨率30,000，隔离窗口0.6 m/z，TurboTMT设置为所有TMT试剂，第一个质量为120 m/z，200％归一化AGC，最大注射时间120 ms）。Faims Pro设置为-30，-50和-70补偿电压（CV）。第二次运行将未分流的样品（蛋白质IP）注入两次，将FAIMS设置为-40，-60和-80 CV。 　　BN-PAGE共摘要样品使用易于使用的NLC 1200系统，该系统耦合到Orbitrap Exploris 480质谱仪（RRID：SCR_022215）。用ACCUCORE 150 C18树脂（2.6μm，150Å）将15厘米100-μm的毛细管色谱柱包装在内部。90分钟的线性梯度在80分钟内从5％到20％的ACN，在83分钟时为25％，在0.125％的甲酸中，在85分钟时为98％，在0.3 µl min-1中使用。DIA方法包括对第一个周期的390–1,014 m/z质量范围的24 m/z重叠隔离窗口的分析，第二个周期为402–1,026 m/z。用28％的归一化HCD碰撞能量，30,000分辨率，145–1,450 m/z扫描范围，1,000％归一化AGC和54毫秒的最大注入时间进行DIA扫描。接下来是父级MS1离子扫描（分辨率60,000，扫描范围350–1,050 m/z，100％归一化AGC目标，自动最大注射时间）。 　　使用FAIMS PRO（RRID：SCR_020562）耦合到Orbitrap Fusion Lumos质谱仪与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪耦合到Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，对DSSO跨链接样品进行分析。90分钟的线性梯度在80分钟内从5％到20％的ACN，在83分钟时为25％，至40％，在0.5 µL min-1中使用0.125％甲酸的98％，在0.125％的甲酸中2分钟。使用了HCD-MS2策略4，其中在Orbitrap上获得了MS1频谱（分辨率为120,000，扫描范围400–1,600 m/z，标准AGC目标，自动最大注射时间）。在21％，27％和33％的标准化碰撞能量下，HCD将带有电荷状态4-8的肽分裂。在Orbitrap上获得MS2（分辨率60,000，隔离窗口1.6 m/z，自动扫描范围，200％归一化AGC，最大注射时间120 ms）。Faims Pro设置为-50，-60和-75 CV（参考文献134）。 　　使用与Faims Pro的Orbitrap Ascend Multiomics Tribicd质谱仪结合到Orbitrap Ascend Multiomics Tribid Spectroper，使用vaM-NEO UHPLC系统分析了DHSO和DMTMM-跨链接样品。90分钟的线性梯度在80分钟内从5％到20％的ACN，在83分钟时至25％，在85分钟时为40％，在0.125％的甲酸中，在0.3 µL min-1中使用了0.125％的甲酸2分钟。在OrbitRap上获得了MS1光谱（分辨率为120,000，扫描范围350–1,600 m/z，标准AGC目标，自动最大注入时间）。在21％，27％和33％的标准化碰撞能量下，HCD将带有电荷状态4-8的肽分裂。在Orbitrap上获得MS2（分辨率60,000，隔离窗口1.4 m/z，自动扫描范围，200％归一化AGC，最大注射时间120毫秒）。Faims Pro设置为-50，-60和-75 CV。 　　用Msconverter135处理TMT-MS数据，并使用Comet136对人类规范蛋白质组（Uniprot Swiss-Prot 2021-11）进行搜索，包括反向序列和常见污染物。搜索包含TMEM230变体的实验，以针对人类规范蛋白质组（Uniprot Swiss-Prot 2024-01）进行搜索，其中包括带有此类变体的TMEM230序列。将肽质量耐受性设置为50 ppm，片段离子耐受性为0.02 Da。选择这些宽大的宽大宽度窗口是为了最大程度地提高灵敏度，并结合彗星搜索和线性判别分析137。将TMTPRO标签设置为赖氨酸和肽N末端（+304.207 DA）上的固定修饰，在半胱氨酸（+57.021 dA）上的羧基氨基甲基化作为固定修饰，以及蛋氨酸残基上的氧化作为可变的修饰。进行线性判别分析138，并将肽 - 光谱匹配（PSM）过滤至2％FDR139。通过在理论M/Z周围挑选最强烈的峰来量化TMT-Reporter离子，并根据同位素杂质进行校正。在所有TMT通道中，只有至少200个信噪比和50％前体隔离纯度的PSM。140。使用MSSTATS141,142进行数据摘要，归一化和统计。启用了肽水平的归一化和插补，并将蛋白质摘要方法设置为“ logsum”，以用于内神经元的内部IP实验和所有其他实验的“ MSSTATS”。用于考虑显着调节蛋白的阈值是0.05 Q值和1.5倍变化。对于使用无神经元进行的PN和Endo-IP实验，分析了每个条件的三个生物学重复（补充表4和5）。对于蛋白质IP实验，分析了每个组的四个生物学重复（补充表5），除了一个数据集外，有一个包含两种重复的数据集，鉴于最大限制了TMT通道数 （补充表4）。使用Syngo143（https://www.syngoportal.org/#）进行突触基因本体富集分析，使用每个实验中鉴定为背景的所有蛋白质。 　　如前所述的144,145，使用DIA-NN（​​1.8版）分析DIA-MS数据。使用MSCONVERT135将数据转换为MZML，其将单位过滤器设置为仅重叠（10-PPM质量误差）。由完整的人蛋白质组（Uniprot 2022-05）生成光谱库，前体M/z范围为350–1,050，前体电荷2-5和碎片离子M/z范围145–1,450。氨基甲基甲基化，氧化和N末端切除作为修饰。使用10-PPM质量精确度，启用了匹配 - 符合型号的LC（高精度）量化策略进行搜索。对于Endo-IP协议优化样本（扩展数据图1I-L和补充表1），使用MS-DAP146进行了下游分析。每个条件的三个重复（n = 3）中仅量化了所有三个重复的肽。将数据通过方差稳定归一化和蛋白质方法之间的模式进行标准化。选择DEQMS算法进行统计分析，使用0.01 FDR调整后的P值阈值的显着性阈值和3（补充表1）。对于BN的共取消实验，用PCProphet25进行了蛋白质复合物分析。用默认参数分析了三个生物学重复，将提供的核心复合物用作数据库，并将BN标记用于将假设折叠为公共复合物。如前所述7，将共洗精度分数（来自RF输出表）分配给了该复合物的每个蛋白质对，并用于下游分析。仅考虑在67 kDa时具有最小峰洗脱的配合物，每络合​​物最多25个蛋白质。此外，我们仅考虑了在两个重复中的分数至少0.7的相互作用，仅恢复高信心候选相互作用（补充表2）。根据在Bioplex7中报道的蛋白质相互作用的最佳恢复基础上选择了这些参数（扩展数据图2B，C）。基于CORUM118的选定蛋白质复合物的洗脱剖面和Pearson的相关热图是使用重复跨复制物的平均归一化洗脱曲线生成的（不包括离群值是中位数最不同的分数）。 　　使用Xlinkx Module147,148，使用Thermo Proteome Discover（2.5.0.400; RRID：SCR_014477）分析了DSSO交联MS数据。针对人类规范蛋白质组（Uniprot Swiss-Prot 2022-05）搜索数据。选择MS2采集策略，具有10-PPM前体质量公差，20 ppm ftms片段质量耐受性和0.6 DA ITMS片段质量公差。氨基甲基化作为固定修饰。包括氧化和N末端乙酰化作为可变修饰。最多允许三个胰蛋白酶分解，并将最小肽长度设置为5。FDR阈值设置为5％，仅考虑Xlinkx分数> 40的交叉链接进行下游分析（补充表2）。所有交联位置的蛋白质结构域信息均从Uniprot检索（图1F），并从参考文献中获得拷贝数。18（扩展数据图2F）。从参考文献中检索出酵母两杂交数据。29和来自Bioplex 3.0的IP数据（参考文献28；扩展数据图2J）。使用SECAT149评估了BN数据集中交联蛋白对的共同分级。按照提供的来自Corum的正相互作用网络和负相互作用网络。目标网络是从交叉链接和BN中鉴定出的蛋白质的所有交联相互作用产生的。使用以下参数来确保所有目标蛋白质成对的得分产生：峰拾取均设置为无，最小的丰度比率为1，最大值比为0，最大Q值为1。secatP值，用于与crosslink数据进行比较，并在cringdb，corum and corum and corum和Bioplex的数据中进行了比较（图3.0）。 　　使用Scout（1.6.2）31分析了DHSO和DSSO交联MS数据。搜索具有默认参数的人类规范蛋白质组（Uniprot Swiss-Prot 2022-05），包括MS1级别上的10-PPM误差和MS2级别的20-PPM错误。氨基甲酸甲基（质量57.02146）和MMTS（质量45.987721）分别作为DSSO-和DHSO交联样品的固定修饰。包括氧化和N末端乙酰化作为可变修饰。最多允许三个胰蛋白酶分解和两个可变修改，并将最小肽长度设置为6。“残留对”表用于下游分析（补充表2）。 　　使用PLINK2（版本2.3.11，RRID：SCR_000084）150分析了DMTMM交联MS数据。搜索具有15-PPM前体质量耐受性和20-PPM片段宽敞耐受性的人类规范蛋白质组（Uniprot Swiss-Prot 2022-05）的数据。将甲基硫酸（C）作为固定修饰包括在内；包括氧化和N末端乙酰化作为可变修饰。最多允许三个胰蛋白酶分解，并将最小肽长度设置为6。将滤波器公差设置为10 ppm，并将FDR阈值分开为PSM水平的1％。过滤后的交联位点用于下游分析（补充表2）。考虑到每个DMTMM或DHSO交联可能匹配多个相互作用，因此DMTMM和DHSO交联映射到由DSSO交联所定义的所有可能的蛋白质相互作用。 　　通过交叉链接和BN鉴定的所有蛋白质对产生PPI网络。最初对该网络进行过滤以去除天然分子重量标记中存在的蛋白质（在BN实验中用作参考的尖刺蛋白），EEA1（EEA1（过表达并用作内体亲和纯化的手柄），UBC（在大多数情况下，对应于蛋白质修饰，而不是蛋白质配合物的蛋白质成员，而不是常见的contamins）（常见的蛋白质配合物）（不适用于蛋白质复合物）（均应）。使用IGRAPH R软件包（RRID：SCR_021238；扩展数据图3A – C）进行网络表征和分析。根据以下注释将蛋白质分配到亚细胞位置：上述评分方法的内体蛋白（补充表1），高尔基蛋白，高尔基蛋白（如参考文献140中策划），溶酶体蛋白，溶酶体蛋白，从参考资料和实验蛋白中的表S3中的BONA FIDE蛋白（BONA FIDE蛋白）（BONA FIDE s3;线粒体蛋白（来自mitocarta3.0（参考文献153））和核蛋白（基于单脂蛋白，蛋白质仅指定为核相关术语，例如“核”和“染色体”）。这些注释和循环r软件包（RRID：SCR_002141）用于生成网络和弦图（扩展数据图3D）。 　　通过过滤可疑的相互作用（即核蛋白），仅包括内体蛋白（由我们的评分方法定义）及其直接相互作用者来生成以内体蛋白（或endomap.v1）为中心的网络。多达8.5％的内体相互作用涉及核蛋白（扩展数据图3D），这可能被认为是可疑的（因此，被过滤掉了），并且可能在样品制备引入的PPI水平上表明错误连通性。仅当通过交叉链接连接到至少一个直接相互作用的人和/或两个直接相互作用器通过BN连接到一个直接相互作用的人时，内体蛋白的二阶相互作用者才包括在内（扩展数据图3E）。使用Cytoscape v3.10.1（RRID：SCR_003032）可视化网络的核心组成部分（即最大的模块），并通过无监督的边缘中间分析检测到蛋白质群落（图2A）。使用G：Profiler（RRID：SCR_022865）对每个社区进行了基因本体论（GO）富集分析，其整个蛋白质组作为背景（补充表2，包括重要的GO细胞成分，GO GO生物学过程和至少具有两个蛋白质的Corum术语）。分配给复合物的蛋白质之间的路径距离分析基于Corum和GO：CC（仅与蛋白质复合物有关的术语；图3B和扩展数据图3F）。与相同程度分布（100个排列）的图形重新布线用作随机对照（图3C）。疾病对内体蛋白质组的疾病过度占代表性分析是在我们的评分方法定义的内体蛋白上进行的，并在GO中注释（GO：0005768，日期，2024年12月）。基因网络（DISGET）154的富集分析是在剂量r软件包中实现的。神经退行性疾病的富集分析包括自闭症谱系障碍，癫痫和严重的神经发育障碍以及精神分裂症基于参考。155，并使用clusterProfiler R软件包（RRID：SCR_016884）进行 以脑表达的基因作为背景。与神经退行性疾病相关的蛋白质之间的路径距离分析基于疾病2.0（参考文献156; 2024-02更新； RRID：SCR_015664），帕金森氏病回顾了Genes16和帕金森氏病基因组疾病基因组基因组基因组基因组协会研究157,158（扩展数据。图3J，K）。 　　AF-M使用Colabfold V1.5.2（参考文献8； RRID：SCR_025453）在40-GB A100 NVIDIA GPU上进行，用于所有由XL-MS鉴定的XL-MS和Endomap.v1中三链组合（总计3,600氨基酸）内的所有蛋白质对）。AF-M版本3与权重型1、2和4一起使用，带有三个回收，启用了模板，一个合奏，没有辍学，没有琥珀放松。提供给AF-M的多个序列比对由MMSEQ服务器（RRID：SCR_022962）生成，具有默认设置（配对 +未配对序列）。如先前所述30,159，计算了SPOC和接触位点。对于成对预测的SPOC> 0.33，预测的质量被认为是可以接受的，至少两个界面平均模型> 0.5的接口，用于计时器预测。如先前所述，使用内蛋白和抑制蛋白DSSO交叉链接进行了Alphalink2（https://github.com/lhatsk/alphalink）。通过使用不同种子，用Alphalink2生成了每种蛋白质对的三个预测。 　　通过查询PDB API的X射线和低温电子显微镜结构，可以检索所有包含XL-MS鉴定的蛋白质对的PDB结构，并具有整体分辨率 <3.5 Å. PDB chains were mapped to their corresponding UniProt identifiers with PDB SIFTS API. Crosslinks were mapped onto the AF-M and PDB structures, and crosslinked residues with a maximum Cα–Cα distance of 35 Å were considered to match the crosslinker constraints. For AlphaLink2, the maximum Cα–Cα distance considered was 30 Å for all crosslinkers, a more stringent threshold as DSSO crosslinks were already used to assist the prediction generation. For AF-M and AlphaLink2 predictions, only crosslinked residues with both pLDDTs >考虑了70个用于距离分析。涉及大量交叉链接的HSP90AA1和HSP90AB1的交联被排除在Alphalink2预测中的距离分布图（扩展数据图4M – O）中，以使分析更具代表整个数据集的代表性。 　　使用HADDOCK2.4 WEB SERVER160（RRID：SCR_019091）对MTORC1隔离器复合物与V-ATPase的关联进行建模。ATP6V1C1 – Lamptor2和AtP6V1C1 – Lamptor4之间确定的交联被用作明确的约束，高距离限制为23Å和质量限制。The complete mTORC1–ragulator complex structure (PDB 7UXH)59 was included with selected subunits of V-ATPase owing to the limitation in the maximum number of atoms (PDB 6WM2 chains I and J from ATP6V1E1, chains L and M from ATP6V1G1, chain O from ATP6V1C1, chains 8 and 9 from ATP6V0C)58.选择了与预期膜拓扑兼容最佳分数的假设模型（群集5；扩展数据图11b）。使用Pymol 2.6.0（RRID：SCR_000305）生成结构图像。所有输入，参数和输出文件均可通过Zenodo网址为https://doi.org/10.5281/zenodo.14679635。 　　以下软件，软件包和资源还用于分析和可视化：rstudio（2023.06.0构建421，r 4.2.1，rrid：scr_001905）;R软件包GGPLOT2（3.5.1，RRID：SCR_014601）;r软件包rcolorbrewer（1.1.3，scr_016697）;R软件包GGREPEL（0.9.5，RRID：SCR_016223）;R包Dplyr（1.1.4）;R软件包Factominer（2.11，RRID：SCR_014602）;r软件包pheatmap（1.0.12，rrid：scr_016418）;R软件包FACTOEXTRA（1.0.7，RRID：SCR_016692）;r包proc（1.18.5）;r软件包reshape2（1.4.4）;R包Igraph（2.1.2）;R包TIDYR（1.3.1，RRID：SCR_017102）;R软件包LME4（1.1.13.5，RRID：SCR_015654）;R软件包GGSIGNIF（0.6.4，RRID：SCR_023047）;r软件包Viridis（0.6.5）（RRID：SCR_016696）;Adobe Illustrator（26.5）;NIAID NIH生物Art来源。 　　样本大小，重复数量和统计测试在图的图例和方法的相应部分中指示。图3D，H和扩展数据图中的验证和代表性实验。5C和7G进行了一次，其中的数据是扩展数据。进行5E，H，K，M和8C进行了两次，图4G和扩展数据中进行了图7F进行了三次，在独立实验中进行了相似的结果。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。