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合成CDN配体购自生物生命科学研究所：C-DI-GMP（目录号C 057）和3'，3'-cgamp（目录数字C 117）。苯甲胺腺苷二核苷酸是Frank Schwede（生物生命科学研究所）的礼物。
重组细菌Sfsting蛋白被重组表达并纯化如前所述4。简而言之，将所有构建体使用Gibson组装克隆到修改的PET16载体中，以表达BL21-Codonplus（DE3）-ril E. Coli（Agilent）26中的重组氨基末端6×His-fusion蛋白26。TIR-TO-TIR跨丝接触突变体ΔA36– K41被设计为甘氨酸 - serine环的更换（D35-GSGG-S42）。接种的1-L M9ZB培养物（0.5％甘油，1％Cas-氨基酸，47.8 mm Na2HPO4，22 mm Kh2pO4，18.7 mm NH4CL，85.6 mm NaCl，NaCl，2 mm，2 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM MM，并补充30 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm的尼古丁尼尼克比尼尼哥和尼克斯州尼克西氏菌Ir虫。230 R.P.M.颤抖。在600 nm（OD600nm）> 2.5处达到光密度的培养物，最终IPTG浓度为500μm，并在16°C下在230 r.p.m上孵育过夜过夜。在裂解缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.5、400 mM NaCl，30 mM咪唑，10％甘油和1 mM Dithiothreitol）中超声检查收集的细菌颗粒，并通过Ni-NTA树脂（QIAGEN）上的重力流量纯化。用补充1 M NaCl的裂解缓冲液洗涤树脂一次，并用300 mM咪唑洗脱重组蛋白。将蛋白质透析在4°C（20 mM Hepes-KOH pH 7.5，250 mm KCl，10％甘油和1 mM二硫代硫醇）下过夜。透析蛋白在加载到16/600 SuperDex 200尺寸-Exclusion柱（Cytiva）上之前，将透析蛋白浓缩在30 kDa-cutoff Amicon离心机过滤器（Millipore）中，以凝胶过滤缓冲液（20 mm HEPES-KOH pH 7.5，250 mm kcl，1 mm kcl，1 mm tce，1 mm tce）。通过将样品浓缩至> 10 mg ml -1，并在液氮中闪烁以在-80°C下储存，从而评估蛋白质纯度。
暴露于活化的配体C-DI-GMP时，纯化的Sfsting的溶液立即开始形成细丝并明显云彩。对于第一个C-DI-GMP数据集，在1 mg Ml-1处的SFST迅速与3×摩尔浓度的C-DI-GMP（84 µm）混合，立即应用于Glow-DiSChiped 1.2/1.3 Cu 300 Mesh网格（量化）中的Glow dive 1.2/1.3 Cu 300 cu 300 Mesh Grid（vantifoil），并在10 s seto ferobe中使用10 s vIT ferobob在10 s vister中，将其固定在10 s visto ferob中。100％的湿度无需等待时间，3 s blot时间和+8印迹力。对于第二个C-DI-GMP数据集，将1 mg ML-1的SFSTING与1 mM苯甲酰胺腺嘌呤二核苷酸预孵育，然后与84 µM C-DI-GMP快速混合，并像上述一样冷冻。用Serialem v3.8.5和v3.8.6进行了半自动数据收集。在300 kV的泰坦krios（Thermo Fisher）上成像，配备有20-eV缝隙宽度的生物试剂K3成像滤波器，并以105,000倍对应于0.825的校准像素大小为105,000倍的标称放大倍数，在计数模式下进行计数模式的K3 summit直接电子探测器（GATAN）。对于第一个数据集，将1.6 s的总曝光时间与总剂量相对应为55.5电子Å -2，在49帧上分数。对于第二个数据集，将1.29 s的总曝光时间（对应于51.7电子Å -2）在51帧上分馏。对于第一个数据集的散焦目标为-1.2至-2.1 µm，第二个数据集为-1.2至-2.5 µm。
对于3'3'-cgamp数据集，在1 mg ml-1处的SFSTING与3'，3'-CGAMP（84 µm）的3×摩尔浓度快速混合，并如上所述冷冻。3'，3'-cgamp数据集在塔洛斯北极（Thero Fisher）上收集在200 kV的塔洛斯（Thero Fisher）上，在计数模式下以K3直接电子检测器（GATAN）的名义放大倍率为36,000×，对应于校准的像素大小为1.1Å。总暴露时间为4.494 s，对应于52.9电子Å2的总剂量，分为50帧。散焦目标为-1.4至-2.6 µm。
数据处理是在CryoSparc v3.1.018（参考文献27）和Relion-3.1（参考文献28）中进行的。对于C-DI-GMP数据集，基于斑块的运动校正和CTF估计是在CryoSparc中进行的。去除具有严重污染或造影剂转移功能不良的显微照片（CTF）拟合。使用模板拾取器在CryoSparc中使用从丝状示踪剂（第一个数据集）或基于BLOB的Picker（第二个数据集）生成的模板在CryoSparc中进行自动颗粒。提取粒子的盒子尺寸为320，并将其下采样至160的盒子尺寸，以进行初始二维（2D）分类和改进步骤。
对于C-DI-GMP结合的SFSTING单丝重建，将基于灯丝示踪剂的粒子坐标和第一个C-DI-GMP数据集中的基于模板的选择组合在一起，并删除了比40Å的重复坐标更接近40Å。在相关中进口异质性细化后，共有277,287个对应于单粒类别的坐标。第二个数据集具有更多捆扎的细丝，并且没有促进单丝重建。使用MotionCor2 V1.4.0（参考文献29）重复全局和局部（12×8斑块）运动校正，然后使用GCTF v1.06（参考文献30）进行CTF估计。2D分类和3D细化后，使用中央细丝周围的掩码对270,695个颗粒进行信号减法，然后进行3D分类而无需对齐。总共恢复了206,965个颗粒，并进行了两轮CTF细化和一轮贝叶斯抛光。使用中央细丝周围的掩膜与抛光颗粒进行一个3D分类。在最后一轮3D细化的最后一轮中，选择了最能解决TIR和STING域的26,447个颗粒的类。在我们的分析中，SFSTING激活被视为尺寸范围的个体丝，一些丝的长度达到300 nm（约85二聚体副本，约为6.3 MDA）。选择用于加工和高分辨率结构分析的颗粒包括至少5个sfsting二聚体副本的密度。
对于C-DI-GMP结合的SFSTING双丝重建，在CryoSparc的每个数据集上独立地进行了多轮异质性完善，以隔离3D不均匀细化后双丝细丝的最佳重建的颗粒。最终重建在第一个数据集中包含176,549个粒子，第二个数据集中包含178,579个粒子。由于未在地图中观察到与苯甲胺腺嘌呤二核苷酸类似物或其他差异相对应的进一步密度，因此将两个数据集中的双丝粒子坐标合并并进行局部运动校正，CTF细化和不均匀的细化。对于所有数据集，尝试应用对称性或螺旋参数会导致下等级重建，因为SFSTING DICERS在寡聚复合物中并不完全对称相关。
对于3'3'-cgamp数据集，基于斑块的运动校正和CTF估计在CryoSparc中进行。去除具有严重污染或较差CTF拟合的显微照片。使用基于BLOB的拾取器生成的模板在CryoSparc中使用模板拾取器进行自动绘制。将颗粒的盒子尺寸为280，进行2D分类，然后进行初始重建和3D不均匀细化。将所得的图和相应的261,685个粒子坐标导出至依赖。分别使用MotionCor2和GCTF重复全局和局部（12×8斑块）运动校正和CTF估计。经过一轮3D分类后，对所有四个链的具有清晰密度的105,567个颗粒进行了CTF的细化，贝叶斯抛光和3D细化，没有两个最定义的链。
FSSTING（PDB 6WT5）CBD用作刚刚进入COOT中的单纤维C-DI-GMP结合的SFSTING密度的起始模型，然后是迭代手动模型buildut31。C-DI-GMP结合的SFSTIND二聚体用作C-DI-GMP结合的双丝细丝和3'，3'-cgamp结合的低聚物的起始模型。在C-DI-GMP双丝细丝中，与其他细丝的刺痛结构域相互作用的中央二聚体的TIR域的个别二级结构元素是通过刚性拟合放置并在COOT中手动调节的。TIR结构域的N末端部分不可见侧链，转化为多酰胺。除去了C-DI-GMP双丝细丝和3'，3'-cgamp低聚物中所有其他SFSTING二聚体的TIR结构域。3'，3'-cgamp结合的Sfsting二聚体可能包含3'，3'-cgamp方向建模和约180°旋转的组合。在两次中，在两轮中使用了多个回合的真实空间改进32。使用Molprobity在Phenix中进行模型验证（参考文献33）。使用Chimerax（参考文献34）和Pymol（v2.5.1）生成图面板。用于数据处理和建模的软件由SBGrid（参考文献35）部分配置。
如前所述，制备了板读取器的反应评估NADase功能4。用反应缓冲液（20毫米HEPES-KOH pH 7.5，100 mM KCl），500 µM烟酰胺1，N6-乙烯二烯二腺苷二核苷酸建立反应的最终体积；（ε-NAD，Sigma），0.1-10 µm酶和20 µm C-DI-GMP。反应是作为PCR管条中的主混合物制备的，并通过在放入板块读取器之前立即添加烟酰胺1，N6-乙烯二腺嘌呤二核苷酸来开始。在300 nm激发后，使用协同H1混合多模式读取器（BIOTEK）连续40分钟读取410 nm处的荧光发射。用GraphPad Prism 9.3.0生成图。
如前所述4，通过电泳迁移率转移测定法监测与放射性标记的C-DI-GMP的SFSTING相互作用。4。简而言之，10μl反应包含1×缓冲液（5 mm mg（OAC）2，50 mM Tris-HCl PH 7.5，50 mm Kcl），最终蛋白浓度为20μM，约1μMα32-P-α32-P标记的C-DI-GMP通过纯化的颤音浮动cholerae dnci（gtp）（gtp）evibio cholio cholio cholio cholio dnci（gtp）产生。将反应在25°C下孵育5分钟，并在6％的非原始聚丙烯酰胺凝胶下在100 V中孵育45分钟，在0.5×TBE缓冲液中分离45分钟。在80°C干燥1小时之前，固定凝胶（40％乙醇和10％冰醋酸）。然后将干凝胶暴露于磷光器存储屏幕上，并在台风三人变量模式成像仪（GE Healthcare）上成像。
将野生型或突变体Sfsting（1 µM）与10 µM C-DI-GMP在缓冲液（20 mM HEPES-KOH pH 7.5，250 mm KCl，1 mM TCEP）中孵育15分钟。然后将混合物直接施加到发光脱落的（30 s，30 mA）400-mesh Cu网格（电子显微镜科学，EMS-400CU）上，涂有大约10 nm的连续碳（Safematic CCU-010）涂层30 s。侧面印迹后，将网格立即用1.5％的铀酰甲酸染色，然后再次从侧面染色。在最后的染色步骤中，用30 s与铀酰甲酸孵育两次染色两次。在120 KEV的FEI TECNAI T12显微镜上收集EM图像，并配备了GATAN 4K×4K CCD摄像机，标称放大倍率为52,000×，对应于2.13Å的像素大小为2.13Å，并以约1 µm的转化为1 µm。
SFSTING和突变构建体以及SFGFP负面控制构建体被克隆到PET矢量中以进行IPTG诱导的表达。将大肠杆菌BL21（DE3）（NEB）用这些质粒转化，然后将其镀在补充有100μgml -1氨苄西林的LB培养基板上。After overnight incubation, three colonies from these plates were used to inoculate 5-ml MDG liquid cultures (0.5% glucose, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 0.25% aspartic acid and trace metals) supplemented with 100 μg ml−1 ampicillin and grown overnight在37°C下用230 R.P.M.颤抖。将培养物1:50稀释到新鲜的M9ZB培养基（补充100μgml -1氨苄青霉素）中，并在37°C下以230 r.p.m的含量生长3小时。颤抖。然后将培养物稀释至M9ZB培养基中的OD600Nm均匀的OD600Nm，并将1：5进一步稀释为补充了5μMIPTG的新鲜M9ZB培养基，以诱导蛋白质表达。将200μl的诱导培养物添加到96孔板中，并在技术上三分之一的技术，并在300分钟内在协同的H1混合动力多模式读取器（Biotek）在37°C的摇动中记录了300分钟。用GraphPad Prism 9.3.0生成图。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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文章不错《活性细菌TIR丝丝复合物的冷冻EM结构》内容很有帮助