Human embryonic lung MRC5 fibroblasts (ATCC) and IMR90 fibroblasts (ATCC) were grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Sigma-Aldrich, D5796) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 U ml−1 penicillin, 100 μg ml−1 streptomycin and 2 mM- 谷氨酰胺并在5％CO2下保持在37°C。MRC5成纤维细胞在大气氧条件下培养，IMR90成纤维细胞在低氧（3％）条件下培养。 　　HEK293T细胞（ATCC）用于慢病毒转导，并如上所述在DMEM中培养，并进一步补充了1％的非注重氨基酸（Sigma-Aldrich，M7145），500μgml-1 G41 G418抗生素（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，A1720）和1MMMM SODMMMMSOD，S8636）。 　　如上所述，使用5％非必需氨基酸和25μgml-1的尿苷中所述，在DMEM中生长了亲本和Rho0骨肉瘤143B细胞。 　　将MAF从耳朵剪接中分离出来，并在DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，12634010）中培养，并补充了10％的热吸收FBS，100μgml-1链霉素，100 U ML-1 Penicillin（100 U ML-1 Penicillin）在低氧条件下（3％氧）与5％CO2保持在37°C。 　　WT和TFAM +/- MEF是从胚胎第12.5-14.5天产生的小鼠胚胎，并在补充了10％FBS（Atlanta生物学）的DMEM（Corning，10-013-CV）中培养。TFAM +/-小鼠最初衍生自从木德氏菌获得的TFAMFLOX小鼠，并如前所述生成24。 　　在DMEM中生长人骨肉瘤U2OS细胞（ATCC），使用10％FBS，2 mM-谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠和5 mM 2-β-cercapto乙醇生长。将细胞与5％CO2保持在37°C。 　　通过将细胞暴露于10 Gy（MAFS）或20 Gy（人成纤维细胞）的X射线照射中，可以实现应力诱导的衰老。通过串行传播细胞实现复制衰老，直到它们达到其复制电势并至少进行4周的人口倍增。衰老是通过p16和p21，sa-β-gal阳性以及不存在增殖标记物Ki-67或EDU掺入的。通过用100 nm 4-羟基tamoxifen（4-OHT）处理细胞，在ER-RAS-IMR90成纤维细胞中实现了OI。将4-OHT保持在培养基中，直到收集细胞为止。 　　为了诱导MIMOMP，用2.5μMABT-737（ABCAM，AB141336）处理增殖细胞9和23天。每48-72小时对治疗进行一次刷新。为了抑制MPTP，用20 Gy X射线照射将细胞辐照，并用1μM环孢菌素A（Sigma-Aldrich，SML1575）处理10天。为了抑制BAX，用20 Gy X射线照射将MRC5成纤维细胞辐照，并在指定的浓度下用BAX抑制剂（BAI1）（ADOOQ BIOSCIENCES，A15335）处理。辐照后直接添加环孢菌素A和BAI1，并在细胞培养基中保持10天（每48-72 h一次刷新一次）。 　　为了进行细胞毒性分析，在评估细胞毒性之前，将细胞用ABT-263以指定浓度处理24小时。 　　对于治疗诱导的衰老，用250 nm的阿霉素或50 µm依托泊苷处理24小时。24小时后，将培养基刷新。细胞在培养物中维持，并在治疗后分别在第10天和第8天收集。 　　用10 µM Eltrombopag（由E. gavathiotis提供）将X射线辐照的细胞处理10天（辐照后立即添加治疗）。每48-72 h一次刷新治疗。在照射后10天收集细胞进行分析。 　　为了诱导线粒体碎裂，在照射后第2和第3天用12.5 µM CCCP处理细胞。在第4天，将细胞培养基刷新，并将细胞保持在培养中，直到辐照后第10天。在第10天收集细胞进行分析。 　　为了抑制BAX，在诱导凋亡之前，将U2OS细胞用2.5μmBAI1预孵育1-2小时。为了诱导凋亡，用10μMABT-737（ABCAM，AB141336）和2μMS63845处理细胞。 　　包含HSV-1 UL12.5的质粒PFU-GEV16和PF5XUAS-UL12.5是G. Hacker的礼物。如先前所述43，生成MRC5-UL12.5细胞。简而言之，首先用PFU-GEV16构建体转染了MRC5成纤维细胞（包含转录激活剂的表达矢量）。选择细胞用湿霉素选择，然后用含有UL12.5序列的慢病毒感染（他莫昔芬诱导），然后选择呼毒素。为了诱导UL12.5，将细胞用100 nm 4-羟基莫昔芬处理48小时。根据制造商的说明，使用QPCR使用QPCR评估线粒体DNA（Sciencell，8948）。 　　所有使用的细胞系都经常测试过支原体污染。细胞系尚未得到认证。 　　如前所述2,23，进行了帕金介导的广泛线粒体清除。简而言之，用12.5μMCCCP（Sigma-Aldrich，C275​​9）（辐照后3天）处理48小时的CCCP（Sigma-Aldrich，C275​​9）（持续48 h）（CCCP每24小时刷新CCCP），用12.5μMCCCP（SIGMA-ALDRICH，C275​​9）处理了表达Parkin的IMR90成纤维细胞。然后，用分离的线粒体DNA（如下所述）在照射后7天用分离的线粒体DNA转染线粒体细胞，并在辐照后10天收集。 　　根据制造商的说明，使用DHARMAFECT KB DNA转染试剂（Horizo​​n，T-2006-01），用15μg分离的线粒体DNA转染了表达Parkin的IMR90成纤维细胞。 　　为了进行胞质分数分析，总共收集了7×106个细胞，并以900克离心5分钟。将上清液丢弃，将细胞重悬于PBS中，然后分为两个1.5 mL eppendorf管。在600克的另一个离心5分钟后，一个管子中的颗粒被冷冻并被视为全细胞分数。将另一根管的颗粒在500μL的缓冲液1（150 mM NaCl，50 mM HEPES pH 7.4、25μgml-1 digitonin（Sigma-Aldrich，d141，d141））中孵育10分钟。将细胞在4°C下以150克离心。上清液在4°C下以150克的速度在150克和17,000克处进行10分钟的离心，从而获得胞质分数。根据制造商的说明，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，69504）提取DNA从全细胞分数中提取。根据制造商的说明，使用Qiaquick核苷酸去除试剂盒（Qiagen，28115）清理胞质分数，并使用纳米型NDROP ND-1000分光光度计测量DNA浓度。 　　对于富含线粒体的馏分，然后在冰冷的PBS中冲洗，通过用5 ml冰冷的PBS刮烧瓶来收集细胞。将细胞在4°C下以800克离心5分钟，并重悬于线粒体分离溶液（MIS）（20 mM Hepes-KOH pH 7，220 mm甘露醇，70 mm蔗糖，1 mM EDTA，1 mm EDTA，0.5 mm PMSF，2 mm DTT）。将样品转移到玻璃均质器中，并使用60笔冲程打开细胞。将匀浆在4°C下以800克离心5分钟。将上清液在4°C下以800克进一步离心5分钟。收集上清液的等分试样作为整个细胞提取物。在4°C下以16,100克离心10分钟。将上清液收集为胞质分数。将含有线粒体的沉淀重悬于1 mL的MIS中，并在4°C下再次以16,100克离心10分钟。重复此步骤，并将所得的颗粒重悬于100μL的MIS中。对于线粒体DNA提取，将线粒体颗粒在4°C下以16,100克离心10分钟，并将沉淀重悬于200μlPBS中。根据制造商的说明，使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，69504）进行DNA提取。 　　根据制造商的说明，使用安捷伦Seahorse XFE96分析仪测量细胞氧的消耗率。将细胞培养基替换为未连接的碱性培养基，45 mg l-1葡萄糖，110 mg l-1丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，S8636），4 mm-glutamine（Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，g3126）。添加以下化合物以测试线粒体活性：0.5μM寡霉素，2.5μMFCCP，0.5μm烤面酮，使用2.5μm抗霉素A。使用自动化的池进行了分析后，将所得的氧气消耗率归一化为细胞数量。 　　The following plasmids were used: LentiCRISPR v2 hBAK (Addgene, 129579), LentiCRISPR v2 hBAX (Addgene, 129580), LentiCRISPR v2-puro (Addgene, 52961), hMFN2 CRISPR (sgRNA 3194; VectorBuilder, VB900133-9722dcw),MFN2 shRNA基因集（Horizo​​n，RHS4533-EG9927），慢病毒PLKO.1空载体控制（Horizo​​n，RHS4080），Apaf1 Crispr，CGAS CRISPR，CGAS CRISPR，Lenticrisrispr V2-Blasti。 　　以下序列用于创建CRISPR-CAS9介导的sting，Apaf1和CGA的缺失：HTMEM173_1 5'-GCAAGCATCCAAGTGAAGGGG-3';htmem173_2 5'-cgggccgcgcgcattggga-3';APAF1 5'-ACAGCCTGCCATTCATCATGTA-3';CGAS 5'-AAAAGTAATATGCACGAGTGT-3'。 　　对于慢病毒转导，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，L3000015），将HEK293FT细胞与包装和包膜质粒VSVG和GAG-POL（Sigma-Aldrich）一起转染HEK293FT细胞。然后，2天后，使用0.45μm孔PVDF滤波器过滤来自转染的含有病毒颗粒的HEK293FT细胞的上清液，并与10μgml -1的多甲氧烯混合，并用于感染感兴趣的细胞。感染后，使用以下抗生素选择成功的CRISPR – CAS9缺失：1μgml -1紫霉素（用于BAX，BAK和CGAS）或Blasticidin10μgml -1（用于APAF1和STING）。 　　通过EVE技术进行细胞培养上清液和小鼠血浆中细胞因子和趋化因子的检测。使用了以下测定：人类细胞因子/趋化因子41-PLEX发现测定法（HD41）和小鼠细胞因子/趋化因子31 pless发现分析阵列（MD31）。 　　根据制造商的指示，使用以下试剂盒：Human IL-6 Duoset ELISA（R＆D Systems，DY206），人IL-8 Duoset ELISA（R＆D Systems，DY208）和人CXCL10/IP-10 Duoset ELISA进行确认。使用Multiskan FC微板读取器（Thermo Fisher Scientific）确定450 nm处的光密度，并通过减去540 nm的读数来纠正。 　　在盖玻片上生长的细胞在2％PFA中固定在0.2％的戊二醛中，在PBS中固定5分钟。SEN-β-GAL染色溶液（150 mM氯化钠，2 mM氯化镁，40 mM柠檬酸，12 mM磷酸钠pH 6.0，1 mg Ml-1 5-溴-4-氯-4-氯-3-氯-3-盐酸-3-氨基甲基 - β-甲基-β-甲基乳糖苷酶（x-gal），x-gal），5 mm potass potass potass potass potass hacyanoferrate（）施用六酰胺甲甲酸酯（）三水合物）（pH 6.0）并在黑暗中在37°C的一夜之间孵育过夜。将细胞在PBS中洗涤3次，然后使用DAPI（Invitrogen）的延长金抗固定剂（Invitrogen）将细胞安装在玻璃显微镜载玻片上。 　　将细胞裂解在裂解缓冲液（150 mM NaCl，1％NP40、0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50 mM Tris pH 7.4、1倍磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒中的H2O中的蛋白质浓度），并使用Bio-Rad Protein aSAY;500-0114;将每个样品的蛋白质（至少15μg）在三甘氨酸凝胶上分辨出来，然后将样品涂在0.45μM聚乙烯二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）（Millipore）中，使用Trans-blot-blot SD半干式转移细胞（Bio-Rad）。将膜用PBS-TWEEN之间阻塞缓冲液（5％奶粉，0.05％Tween-20在PBS中），然后在4°C下与原代抗体一起过夜（补充表2中提供了使用的抗体列表）。在蒸馏水中洗涤后，将膜与过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1小时。然后将膜用清晰的ECL Western Blot底物（Bio-Ras，170-5060）或Kwikquant Western印迹检测试剂盒（Kindle Bioscience，r1100）根据制造商的说明，并根据LAS4000（Fujifilm）或Kwikquant Imasience，D1001（undiots Imeosience，d1001）可视化，并可视化补充图1）。使用ImageJ分析蛋白质条带的信号强度。 　　将在150 cm2烧瓶中生长的细胞被胰蛋白酶素化并汇集，以获得足够的材料进行测定。PBS洗涤后，将细胞以900克离心5分钟。Cell pellets were then lysed using CHAPS lysis buffer (1% (w/v) CHAPS, 20 mM HEPES at pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol, 1 mM PMSF, 10 μg ml−1 leupeptin, 10 μg ml−1 pepstatin, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM sodium钒酸盐和20 nm微囊藻蛋白）在4°C下持续30分钟。将样品稀释至包含10 mg ml-1的蛋白质，并将200μl注入SuperDex S200尺寸排除柱。收集了二十500μl的分数。然后使用三氯乙酸（TCA）进行蛋白质沉淀。简而言之，将样品与10％Triton X-100的十分之一样品体积和100％冰冷的TCA的五分之一的样品体积在冰上孵育20分钟。然后将样品在4°C下800克离心5分钟，将上清液丢弃，并用1 ml冰冷的10％TCA洗涤一次，并在-20°C下用1 ml丙酮洗涤两次。将颗粒放在室温下干燥，然后在样品缓冲液（4×Laemmli样品缓冲液，Bio-Rad，1610747）中溶解，并用1％2-甲醇（Bio-Rad，1610710）溶解在样品缓冲液中。使用梯度以前（Bio-Rad，230，165-2700）产生的4–20％丙烯酰胺Tris-Glycine凝胶分离蛋白质。将蛋白质转移到生物体NT硝基纤维素膜（Pall Corporation，66485）中，并根据上述方法进行免疫印迹。 　　按照Illumina的建议，测序文库由聚（A）RNA制成，并使用Illumina Gaiix或NextSeq 500 Sequencer进行了测序。使用FASTQC算法评估RNA-Seq配对末端读数的质量，然后使用两次通行器对齐管道使用剪接感知的对准器与人类基因组对齐。参考接头由Gencode GRCH38（HG38）构建的参考转录组提供。使用Deeptools生成大翅文件。使用HTSEQ计数计算每个基因的原始读数计数。然后使用线性建模工具deseq2使用读取计数矩阵进行差分表达分析。显着变化的表达被定义为经经过的假比率校正的p≤0.05。使用袖扣生成每百万个映射读数（FPKM）值的每千倍片片段。使用基因集富集分析（GSEA）和Ingenuity途径分析（IPA）软件进行基因本体分析。 　　除非另有说明，否则所有动物实验均根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行，除非另有说明。男性和女性老年野生型C57BL/6小鼠（年龄18-20个月）是从美国国家老化研究所（NIA）获取的，并在23-24°C的12 h – 12 h灯光周期下保持在无病原体的设施中，并随意获得常规的食物和水。小鼠以3-5组为同性笼子中。将动物随机分配到车辆或治疗组中。将小鼠腹膜内注射，每公斤BAI1 10 mg（Tocris Bioscience，2160）每周3次，持续3个月，此时将动物安乐死并收集组织以进行分析。在寿命研究中，每周进行三次注射BAI1直到死亡。每2个月进行一次脆弱的评估，因为这些测量是无创的。如果老鼠遇到了人道的终点，则被安乐死，被认为死了。使用对数秩检验通过右审核的Kaplan-Meier曲线分析来评估生存。 　　O. sansom捐赠了bak - / - ; baxfl/fl小鼠（混合背景；男性和女性）。每天对小鼠进行监测，并保存在传统的动物设施中。使用BAK - / - ; BAXFL/FL小鼠进行的实验是根据英国家庭办公室许可进行的，并由格拉斯哥大学动物福利和道德审查委员会批准。小鼠是通过Transnetyx基因分型的。AAV-CRE病毒在100μLPBS（AAV8.TBG.PI.CRE.RBG，UPENN矢量核心，AV-8-PV1091）中通过尾静脉注射（2×1011斑块形成单位（PFU）（每只小鼠））在8周大的小鼠中传递。注射后一周，用4 Gy照射小鼠。6天后将小鼠安乐死，并将肝脏收集到10％中性缓冲的福尔马林中。 　　通过尾部注射（每只小鼠2×1012 pfu），将年龄（17-20个月）Baxfl/flbak - / - （混合背景；男性和女性）施用AAV9-CAG-EGFP或AAV9-CAG-EGFP或AAV9-CAG-ICRE/EGFP病毒（在100 µL PBS；在100 µL PBS； vector Biolabs中）（2×1012 PFU）。注射后3周将小鼠安乐死，并收集组织进行分析。 　　这些动物是在断奶时随机分配的。一旦分配给组，在所有研究完成后数据分析之前，基因型或治疗组才与数字联系起来。小组规模估计是基于功率分析和以前的经验。 　　在实验和结果评估过程中，研究人员对分配视而不见，并以盲目的方式收集和分析了数据。 　　使用加速的Rotarod系统（Ugo Basile，Rota Rod 47650）对最大步行速度和潜伏期进行评估。在测试日之前，对小鼠进行了连续3天的rotarod训练。训练由在第1、2和3天分别以4、6和8 rpm在4、6和8 rpm的速度上留在Rotarod上的小鼠组成。在测试当天，将小鼠放在旋转缸上，在200 s间隔内，速度从4 rpm增加到40 rpm。记录了鼠标从圆柱体上掉落的速度和延迟。结果是三个试验的平均值。 　　使用钢丝测试44进行神经肌肉协调的评估。将小鼠放在水平杆上，直径为1.5厘米，距离地面60厘米。记录了老鼠能够在酒吧上花费的时间。如果小鼠可以将小鼠保留在60 s而不会掉落的情况下，则认为一项试验被认为是成功的。在试验之间进行了五次试验，在试验中休息了30 s。 　　通过允许小鼠握住悬挂的金属丝衣架（直径为2 mm，长度为30 cm），通过使用其前肢来评估前肢握力强度的评估。记录了抓握后的鼠标能够从电线上悬挂的时间，并给每只鼠标进行了10次尝试（中间20 s）的尝试，总计总计90 s。成功被定义为能够悬挂的总和为90 s。如果动物从电线上掉下来，则将试验定义为失败。 　　使用基于先前的研究33的30参数指数评估脆弱性。对于每个参数，给出的小鼠分别为0、0.5或1分别对应于缺席，轻度或重度表型。记录体重，并使用红外温度探针测量表面体温。对于肌张力障碍评估，给出了1-4的得分，其中1个得分等于用一个肢体扣紧，而如果动物表现出所有四个四肢的扣子，则得分为4。 　　所有骨成像和分析均以盲目的方式进行。使用µCT系统（Skyscan 1276 Scanner，Bruker）对腰椎（L5）和股骨（近端近路/中轴diaphy）的骨微结构的定量离体分析。扫描设置如下：55 kV，200 µa，10 µm Voxel尺寸，360°的0.4°旋转步骤和4帧的平均成像为0.25 mm A1滤波器。Skyscan NRECON软件用于重建扫描，并进行后对齐和光束硬化校正。使用Bruker CTAN软件的制造商协议得出µCT参数，该方案允许对小梁和皮质骨参数进行评估。股骨的腰椎（200片）和股骨近端（100片）评估小梁骨体积分数（BV/TV；百分比）。此外，在股骨的近端间断和中部二次分析（50片）上，评估了皮质厚度（CT.TH; mm），内皮圆周（E.C; mm），骨膜周长（P.C; mm）和皮质孔隙度（CT.PO，百分比，百分比）。此外，得出了骨扭转强度的估计（即惯性的极矩； MM4）。 　　对于骨骼，如前所述产生占骨细胞富集的细胞样品45。将样品在Qiazol裂解试剂（Qiagen）中均匀，并立即存储在-80°C下。使用Qiazol裂解试剂提取总RNA，然后使用Rneasy Mini柱（Qiagen）进行纯化。对于肝脏，使用了大约3 mm3稳定在rnalater（Qiagen）中的截面。根据制造商的说明，使用RNAeasy Mini试剂盒（Qiagen，74106）提取肝脏和细胞的RNA（在肝脏中进行了额外的DNase I处理以去除基因组DNA污染）。根据制造商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，4368814）合成互补的DNA。使用C100TM热循环仪（Bio-Rad），ToughMix Perfecta（Perfecta QPCR ToughMix，Quantabio，95112-250）使用Power Sybr绿色PCR主混合（Invitrogen，4367659）进行QPCR进行QPCR（用于肝样品）或使用SYBR Green（Qiagen）作为检测方法（用于骨骼）的ABI Prism 7900HT实时系统（Applied Biosystems）。使用该方法计算mRNA水平，并标准化为管家基因。对于143B和MTDNA耗竭的143B Rho0骨肉瘤细胞，根据制造商的说明，使用基因JET基因组DNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）提取DNA。使用纳米体定量DNA，并存储在-20°C下。使用20 ng基因组DNA使用辉煌的III SYBR绿色Q-PCR Master Mix（Agilent Technologies）进行QPCR。补充表3和4中提供了使用的引物列表。 　　使用2％多聚甲醛在PBS中固定在盖玻片上生长的细胞10分钟。将细胞在PBS中洗涤，然后在PBG-Triton（PBS，0.4％鱼皮明胶，0.5％BSA，0.5％Triton X-100）中透化45分钟。随后，将细胞与原代抗体在4°C下孵育过夜。PBS洗涤后，在室温下施用二抗并在室温下孵育45分钟。将盖板安装在带有DAPI（Invitrogen）的延长金抗固定器的玻璃显微镜载玻片上。补充表1提供了使用的抗体列表。 　　对于线粒体蛋白，将细胞固定在4％多聚甲醛中的0.02％戊二醛中固定10分钟，在PBS中洗涤，并在PBS中在0.5％Triton X-100中透化10分钟。将细胞在5％的正常山羊血清（NGS）中阻塞1小时。如上所述，与一抗和次级抗体一起孵育。按照制造商的说明，使用Celllight线粒体RFP BACMAM 2.0（Thermo Fisher，C10601）标记线粒体。 　　将福尔马林固定的石蜡包裹的组织切片（5 µm）在二甲苯中脱蜡（每个3次3分钟），并使用100％乙醇（两次5分钟），70％乙醇（5分钟）和蒸馏水（每人两次）进行水合。通过将切片在柠檬酸盐缓冲液pH 6.0（Agilent-Dako，S236984）中加热到98°C来完成抗原检测。允许载玻片冷却30分钟，然后在TBS中冲洗两次5分钟。在室温下用NGS（Agilent-Dako，X090710-8）阻塞组织切片，然后在4°C下孵育过夜。将切片在TBS中洗涤，并在室温下与过氧化物酶块（Agilent-Dako，K500711）一起孵育30分钟。然后在室温下施加偶联的HRP偶联二抗30分钟，然后洗涤TBS和DAB孵育5-10分钟。根据标准程序，将切片用血久毒素染色。补充表1提供了使用的抗体列表。 　　将福尔马林固定的石蜡包裹的组织切片在100％的组织学中脱蜡，通过100％，90％和70％乙醇的分级乙醇系列（每个两次）进行水合，并在蒸馏水中洗涤5分钟。通过将切片放在0.01 m的柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原检索，并将其加热至沸腾10分钟。将切片冷却至室温，然后在蒸馏水中洗涤5分钟。然后使用BSA/PBS中的正常山羊血清（1:60）进行阻塞30分钟，然后在4°C下与兔单克隆抗-γH2AX抗体（1：400，9718;细胞信号传导）过夜孵育。三个PBS洗涤后，将组织与山羊抗兔生物素化的二抗（1：200，PK-6101; Vector Labs）在室温下孵育30分钟。然后将切片在PBS中洗涤3次，并与荧光素Avidin DC（1：500，A-2011; Vector Labs）在室温下孵育30分钟。然后将组织在PBS中洗涤3次，并在4％多聚甲醛中在PBS中孵育20分钟以进行交联。三个PBS洗涤后，将切片在分级的冷乙醇溶液（70、90、100％）中脱水3分钟，然后允许风干。接下来，10μL的PNA杂交混合物（70％去酰胺（Sigma-Aldrich），20 mM MGCl2，1 M Tris pH 7.2，5％阻断试剂（Roche），含有2.5μgml-1 Cy-1 Cy-1-3-3-3-3-3-labeld-labeld tabelled tagemere特异性（ccctaaA）panece and panece and panece panece panece sitientic（panece）核酸酸性（ccctaa）核酸酸性（ccctaa）核酸酸性（核酸盐）sicece（允许在80°C下发生10分钟。然后将切片在黑暗的室温下在PNA杂交混合物中孵育2小时，以使杂交发生。将组织在70％甲酰胺中在2×SSC中洗涤10分钟，然后在2×SSC中洗1分钟，然后洗涤10分钟。使用DAPI（Invitrogen）的延长金抗固定器安装组织，并使用深入的Z堆叠成像 （至少有40个光学切片，具有×63物镜）。 　　将细胞固定在0.1％的戊二醛中，在0.1 mol L -1磷酸盐缓冲液中固定细胞2小时，然后在900G下收集5分钟。为了进行冷冻保护，将细胞与2.3 mol L -1蔗糖在0.1 mol L -1磷酸盐缓冲液中孵育过夜，然后在液氮中冷冻。使用Leica冷冻微晶组切割薄的冷冻切片（60 nm）。将切片与4°C的一抗（1:20）一起孵育过夜。然后将切片与10 nm的抗小鼠IgG金二抗（Sigma-Aldrich，G7652）在室温下孵育2小时。洗涤后，将切片固定在1％的戊二醛中，并嵌入含有0.3％乙酸铀酰的2％甲基纤维素溶液中。使用JEOL 1200电子显微镜（Mayo Clinic Core显微镜设施）成像60至80 kV的样品。 　　根据制造商的说明，使用乳酸脱氢酶测定法（ABCAM，AB65939）评估了细胞毒性。简而言之，将细胞生长在24孔板中，并如图所示。在进行测定的那一天，将50 µL的细胞培养基与50 µL的LDH反应混合物混合，然后吸入96孔板。使用带有450 nm滤波器的板读取器测量吸光度。 　　在24孔板中，将U2OS细胞以每孔约20,000个细胞接种。使用Incucyte S3软件（Sartorius）和Sytox Green在30 nm作为细胞死亡读数进行细胞死亡测定，并在细胞死亡后将其用于细胞。使用ABT-737和S63845分别以10μM和2μM诱导细胞死亡。每小时以×10放大倍率拍摄每小时24小时的图像（每孔四张图像）。使用Incucyte S3 2022软件进行分析，该软件具有良好的细胞汇合度标准化的Sytox计数。 　　使用毛睾丸DNA（HT-DNA; 1 µg Ml-1; Sigma-Aldrich，D6898）使用Lipofectamine 3000试剂（Thermo Fisher Scientific，L3000008）转染增殖的plenti或bax - / - bak - / - 细胞。为了评估BAI-1的特异性，转染前24小时用DMSO或BAI-1（2.5 µm）处理细胞。用HT-DNA转染后20小时收集细胞进行分析。 　　用200 nm阿霉素诱导细胞衰老24小时，并发育9天。将一小部分增殖和衰老细胞固定并保存以进行MS分析（总细胞对照样品）。将其余细胞重悬于线粒体分离缓冲液中（MIB：20 mM HEPES pH 7.6、220 mm甘露醇，70 mM蔗糖，1 mM EDTA），并用散发均匀均匀均质均质，然后在850g的850g中心分解5分钟，4°C。在4°C下以10,000g的含量将粗线粒体固定5分钟，并再次洗涤。总共保留了50 µg的线粒体以进行进一步的MS分析（粗线粒体对照样品）。 　　A total of 400 µg of mitochondria was resuspended in ice-cold co-IP buffer (20 mM HEPES pH 7.6, 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 1 mM EDTA, 1% CHAPS (w/v), protease inhibitor cocktail), lysed on ice for 30 min and cleared from insoluble material at 10,000g, 30 min, 4 °C.总共将1 µg抗BAX6A7抗体（NBP1-28566，Novus生物学）固定在蛋白质G偶联的Dynabeads（Invitrogen）上。将珠子用co-IP缓冲液洗涤两次，并与清除的线粒体提取物合并。激活的BAX复合物在4°C下轻轻摇动在4°C下进行一次免疫沉淀。将珠子用冰冷的涂料式缓冲液洗涤3次，并用无CHAPS的co-IP缓冲液洗涤两次。 　　将珠子重悬于2 M尿素，5 mM二硫代硫醇，50毫米碳酸氢铵和50 ng胰蛋白酶（promega）中，并在室温下温和搅拌在室温下孵育30分钟。将样品与40毫米氯乙酰胺混合，并在室温下温和搅拌30分钟。收集具有洗脱蛋白的上清液。将共有50 ng的LYSC（Promega）添加到蛋白质脱酸盐中，并补充100 ng的胰蛋白酶。将蛋白质在37°C的剧烈摇动下消化过夜。将肽在Affinisep Spe-Disks-C18上脱盐，并通过液相色谱分离。 　　将细胞和线粒体颗粒重悬于8 m尿素，50 mM三甲基铵和蛋白酶抑制剂鸡尾酒中。将染色质降解在水浴超声器（10分钟，周期30/30 s）中，然后进行苯并酶HC核酸酶处理。通过在20,000克（4°C）下离心去除不溶性材料。在5 mM二硫代硫醇中，总共降低了50 µg的蛋白质1小时，并与40 mM氯乙酰酰胺一起孵育30分钟。将样品进行顺序的LYSC和胰蛋白酶消化（1:75酶与底物比，过夜，37°C）。将肽在Affinisep Spe-Disks-C18上脱盐，并通过液相色谱分离。 　　使用Dionex Ultimate 3000 Nano-LC系统在IMOL波兰科学院的蛋白质组学核心设施中进行测量，并通过易于使用的离子源（Thermo Fisher Scientific）耦合到Q-激活HF-X。用最大的1.6.17.0处理数据，并使用内置的仙女座搜索引擎从搜索的MS/MS光谱中识别肽。对数据进行了非定量分析。 　　将年龄（> 16个月大）的C57BL/6 J雄性小鼠禁食过夜，并随意提供水。给小鼠给药后4小时可随意获得认证的啮齿动物饮食。在以下目标条件下，将小鼠饲养在受控环境中：温度为20-26°C；相对湿度为40％至70％。每天监测温度和相对湿度。电子时间控制的照明系统用于提供12 h – 12 h的光线周期。在3.5％DMSO，14％PEG-400，75％Gamma-Cyclodextrin（20％）中，在0.1 M柠檬酸盐缓冲液pH 6，7.5％0.5％0.1 M M Citrate Buffer pH 6中通过腹膜内途径，将每个指示的时间点的三只小鼠BAI1（每公斤10 mg）（每公斤10 mg），14％PEG-400，75％Gamma-Cyclodextrin（20％）。将小鼠安乐死，并在0小时，1 H，2 H，4 H，8小时和24小时收集脑组织。剂量给药后0小时的样品收集是立即收集脑组织。通过用4卷（MEOH/15 mM PBS 1：2）的4卷（w/v）组织均质组织制备脑匀浆，并使用液相色谱与串联MS生物分析的液相色谱法分析BAI1浓度。 　　使用共聚焦显微镜（SP8 Leica和LSM780 Zeiss）和超分辨率显微镜（使用Airyscan型检测器LSM800 Zeiss Airyscan；使用Zeiss Elyra P.1超级分辨率系统的SIM）进行成像。 　　使用ImageJ手动对BAX（6A7）的BAX呈阳性的肌外侧DNA灶和线粒体阳性分析。 　　为了可视化细胞质细胞T C，使用自量X3反卷积处理CLSM图像进行反卷积。随后使用COLOC2 ImageJ插件确定了每个单元格的Pearson R值。 　　对于线粒体泄漏的3D可视化，IMARIS 9.6图像可视化和分析软件。 　　使用Leica SP8共聚焦显微镜上的Z-stacks通过3D成像标记的细胞中获取了模拟分析的图像。每次成像的盖玻片都获得了大约30个Z堆栈。成像后，使用Huygens Deonvolution软件处理显微照片。使用Huygens反卷积软件中的共定位工具评估共定位水平。 　　根据用户指南（CG000553，REV B），使用铬的下一个宝石单细胞固定RNA制备试剂盒（10倍基因组学）从闪烁液体冻结的小鼠脑组织制备固定的单细胞悬浮液。在4°C下固定切碎的组织24小时。使用Gentlemacs Octo解散剂（Miltenyi）进行细胞解离。使用单质子铬固定RNA分析试剂盒（CG000477，REV C）构建库。将探针在42°C下孵育20小时，并对索引PCR进行9个周​​期。在NextSeq500（Illumina）系统中对库进行了测序。 　　GraphPad Prism v.9.0用于统计分析；当P≤0.05时，结果认为结果具有统计学意义。对于正态分布的数据，使用独立样本的两尾t检验测试了两组之间的统计显着性。对于正态分布的数据以及一组以上的数据时，使用了单向方差分析，并在Tukey的事后测试后进行了比较。如果数据未正常分布，则使用Mann-Whitney U检验来确定统计显着性。 　　所有动物实验均根据Mayo Clinic机构动物护理委员会（IACUC）批准的方案进行。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。