研究过程是欧洲和美国研究人员之间的合作。引用反映了冠状病毒感染的全球性质和兴趣。作者根据其特定的专业知识来定义角色和职责，以确保最高质量标准。动物研究得到了地方伦理委员会的批准（请参阅指定部分）。没有人参与。使用病原体的所有实验均在适当的生物安全 - 触及级实验室中进行。 　　在图3E中，显示了叙利亚金仓鼠的H＆E染色的左肺叶显示，这些仓鼠感染了SARS-COV-2和车辆或JNJ-9676。在该实验中，每组五只动物的左肺的完整横截面由熟练的病理学家评估。 　　在扩展的数据图2G中，未切割的蛋白质显示了纯化的M蛋白。这些印迹一次是作为获得蛋白质的质量控制的。 　　在扩展数据图6a中，显示了来自SARS-COV-2 M – FABB – JNJ-9676数据收集的显微照片。为了获得此代表性图像，拍摄了12,988张图像。 　　JNJ-9676的合成在专利WO-2024/008909和补充方法中进行了描述。在Medchemexpress（HY-135853）下订购了Molnupiravir，并根据文献程序合成Nirmatrelvir59。对于体外实验，将JNJ-9676，molnupiravir或nirmatrelvir溶于100％二甲基亚氧化二甲基亚氧化物（DMSO）中，为5-100 mm的库存。For in vivo experiments, JNJ-9676 was dissolved in 100% polyethylene glycol 400 (PEG400) as stocks of 75, 25 or 8.33 mg ml−1, molnupiravir was dissolved in 100% PEG as a stock of 300 mg ml−1 and nirmatrelvir as a stock of 250 mg ml−1. 　　如前所述32，VEOE6-EGFP细胞是培养物。人类上皮细胞系A549稳定表达HACE2（A549-HACE2）是从SARS-COV-2和SARS-COV实验中获得的Invivogen，或从美国类型的培养物中（ATCC，CCL-185）获得的，用于生物性生物病毒的实验。按照指示对细胞进行培养。以空气 - 液界面形式生长的汇总供体鼻皮细胞是从上皮获得的，作为完全分化的培养物，并保持在粘膜培养基（上皮）中。除非另有说明，否则将所有细胞保持在5％CO2中的37°C。检查所有细胞培养物是否有支原体污染，并发现阴性。 　　SARS-COV-2构造B1（BetaCov/BETACOV/GHB-03021/2020，EPI_ISL_407976），DELTA B.1.617.2（HCOV-19/BELGIUM/REGA-7214/2021）（HCOV-19/BELGIUM/1-SPL21-P1/2021，EPI_ISL_7413964）从比利时鲁汶大学获得。 　　SARS-COV（法兰克福菌株FFM1； GenBank登录号：AY291315）是从歌德大学获得的。 　　在Veroe6-EGFP细胞中六个通道后获得病毒库存，然后将其等分，闪光并储存在-80°C下。 　　如先前所述的60,61,62，得出了源自PGCOV GD/2019，RSSHC014和WIV-1表达纳米酸酯酶PGCOV GD/2019，RSSHC014和WIV-1表达纳米酸酯酶的重组病毒。 　　如前所述，JNJ-9676抗病毒活性和对SARS-COV-2（B1菌株）和SARS-COV（FFM1菌株）的抗病毒活性和复合毒性在基于A549-HACE2细胞中基于高含量成像（HCI）的感染测定中确定。 　　以前描述了JNJ-9676对SARS-COV-2 B1菌株，Delta变体和Omicron BA.1 Veroe6-EGFP细胞中的抗病毒活性。 　　使用MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基））-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-硫磺苯基）-2H-二甲基）-2H-2H-四唑，内盐分析分析对第5天的细胞毒性进行了评估。 　　如前所述61,62,66,67，在A549-HACE2细胞中对PG-COV，WIV-1和SHC014（人畜共患病毒病毒）进行了抗病毒测定。补充方法中详细介绍了针对其他人类冠状病毒的抗病毒测定。 　　在Mucilair培养基（上皮）中制备JNJ-9676或媒介物（0.2％DMS​​O），并在第1天添加到带有合并的鼻色上皮细胞的24孔粘膜板（Corning Costar透明PS板，默克）的基础室中。然后，1小时后，将插入物在37°C下用SARS-COV-2（0.1，B1菌株的多重感染（MOI）（MOI）（MOI）感染1小时，然后进行三个PBS洗涤。在24和48 h时，收集了顶部洗涤。48 H.P.I.后，使用200 µL RLT缓冲液（QIAGEN）裂解细胞。使用Magna Pure 96 DNA和病毒NA小体积试剂盒和Magna Pure 96 Pure 96 Cellular RNA大体积试剂盒，用于使用Magna Pure 96 DNA和病毒NA小体积试剂盒进行自动RNA提取，用于细胞提取物。对于顶端洗涤，在RNA提取之前包括外部裂解步骤（Roche裂解缓冲液）。使用LightCycler多路复用RNA病毒主基因（Roche）和SARS-COV-2引物和探测器（位于nucleocapsid基因； httpps：//stacks.cdc.gov/piew/ciew/84525）和IN845252525252525252525252525252525252552525252525）和概率和IN84525252525252525252525252525252525）和概率和IN84525252525252525252525252525252525）和概率和IN84525252525252525252525252525252525）在LightCycler 480实时PCR仪器（Roche）上，使用对数稀释序列（内部生成的）对数稀释系列（内部生成）进行了绝对定量。 　　通过使用EVOM3（World Precision Instruments）代表细胞层的完整性或健康状况，通过将未感染的JNJ-9676浓度与JNJ-9676相同的JNJ-9676浓度来评估毒性。Brefeldin（0.3 µM；内部合成）用作毒性控制。 　　使用GraphPad Prism v.8进一步分析了数据。 　　A549-HACE2细胞（每孔8,000个细胞，96孔黑色聚苯乙烯组织培养板（Sigma-Aldrich））在九点稀释系列中播种到预发现的DMSO脱离的化合物上。包含DMSO的列用作对照。在第2天，将细胞用SARS-COV-2病毒（MOI，0.1）感染2小时，然后用PBS洗涤细胞，将化合物刷新，并在37°C下再孵育48小时。在第4天，使用Atplite试剂和ViewLux仪器（Perkinelmer）进行了细胞毒性读数。同时，使用Magna Pure仪器（Roche）和Magna Pure 96 DNA和病毒小体积试剂盒或Qiaamp病毒RNA Mini Kit（Qiagen），从接种板中收集上清液，以进行RNA提取。如上所述，使用LightCycler多重RNA病毒主试剂盒（Roche）和SARS-COV-2引物和探针进行一步RT-QPCR。 　　在补充方法和补充表1中描述了使用JNJ-9676进行的IVRS实验和SARS-COV-2的位置定向突变体的产生。这些突变对JNJ-9676的抗病毒活性的影响通过基于HCI的基于HCI的抗病毒分析评估了JNJ-9676的影响。扩展数据表5中介绍了使用的MOI的概述。使用PHAEDRA HCI分析软件（V.1.0.10.202309011029）进行了分析。与重组WT病毒相比，突变病毒的EC50倍数变化。计算出的效力偏移转化为对数尺度，并使用GraphPad Prism v.9.5.1将其视为热图。 　　The gene encoding SARS-CoV-2 M protein (1–222, UniProt: P0DTC5) was synthesized and cloned into a pcDNA3.4 vector, with an added C-terminal linker sequence, an ALFA-tag and a C-tag (SNSLEVLFQGP-SRGGSGAAAGSGSGSGSPSRLEEELRRRLTE-GS-EPEA). 　　根据制造商的方案将SARS-COV-2 m转染到Expi293F细胞（Invitrogen）中，并在37°C下与8％CO2孵育72 h。通过以1,000克离心收集细胞，用1×PBS洗涤，闪光并储存在-80°C下。 　　将SARS-COV-2 m的细胞颗粒解冻，并重悬于裂解缓冲液中（20 mM HEPES pH 7.5，250 mM NaCl，5％甘油（V/V），蛋白酶抑制剂（Roche），50 U ML-ML-1的Nuclease）。使用玻璃DOUNCE均质器匀浆细胞悬浮液，然后使用M110Y微流体（微流体）裂解。将细胞裂解物以167,900克离心1小时，以收集膜。将膜重悬于相同的缓冲液中，并通过将Lauryl麦芽糖Neopentyl甘氨酸（LMNG，Anatrace）和胆固醇半酸酯（CHS，Anatrace）添加到最终浓度为1％和0.1％（w/v）中。在4°C下孵育2小时后，通过以167,900g离心30分钟收集上清液，并与C-TAG树脂（Thermo Fisher Scientific）在4°C下与C-TAG树脂（Thermo Fisher Scientific）一起孵育2小时，并轻轻旋转。用洗涤缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5，250 mm NaCl，1.25％甘油（V/V），1 mm EDTA，0.0025％LMNG（w/v），0.00025％CHS（W/V）洗涤树脂（20 mM HEPES pH 7.5，250 mm NaCl，1.25％NaCl，1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），1.25％NaCl（V/V），0.0025％CHS（w/v）。使用3 CV洗脱缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、150 mm NaCl，1.25％甘油（V/V），1 mM EDTA，0.0025％LMNG（w/v），0.00025％CHS（W/V），3 mm C-TAG Peptide（VivIvitIde））。该蛋白通过缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.001％LMNG（W/V），0.0001％CHS（W/V），0.00033％Glycol diosgenin（glycol diosgen）（gdn; W/w/w/w/v），在超级糖6上增加10/300 GL柱（Cytvia）上，进一步纯化了蛋白质。 　　对编码fabb2的重链的序列进行了修改，以包含截断的C末端，以阻止Fab二聚体形成（-CKPCICTVPEVSS），并用添加的6×His-Tag包含一个链接器（GS-GS-HHHHH）的添加的C端子6×His-Tag将其克隆到PCDNA3.4载体中。将编码FabB2轻链的序列克隆到PCDNA3.4载体中，并带有添加的N末端Gluc信号序列（MGVKVLFALICIAVAEA）。 　　根据制造商的方案将含有FABB重链和轻链的pcDNA3.4载体共转染为Expi293f细胞（Invitrogen），并在37°C下与8％CO2一起孵育96小时。 　　将条件的培养基以8 ml min -1的流速加载到10 mL Histrap Excel柱（Cytvia）上。将色谱柱用6 cV的洗涤缓冲液（20毫米磷酸钠pH 6.5，150毫米NaCl，20 mm咪唑）洗涤，并使用39.2-500 mm咪唑梯度在缓冲液中制备的5厘米以上超过5 cV洗脱，磷酸盐含量为20 mm，磷酸钠pH 6.5，150 mm nacl，Nacl，500 mm imiDaz）。随后将FABB的峰分数纯化为缓冲液（20 mm磷酸钠pH 6.5，150 mm NaCl）的HiloAD 16/600 SuperDex 75 pg柱（Cytvia）。 　　将SARS-COV-2 m和FABB以1：2.5的比例混合，并在冰上孵育1小时。将SARS-COV-2 M – FABB复合物加载到Superose 6增加10/300 GL柱（Cytvia）中，该柱（Cytvia）用缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.001％LMNG（W/V），0.0001％CHS（W/V），0.000333％GDN（W/V））。合并了含有SARS-COV-2 M-FABB复合物的峰值级分，加入100 µM JNJ-9676并在冰上孵育1小时。将样品稀释至0.2-0.8 mg ml-1，使用含有100 µM JNJ-9676的尺寸排斥色谱（SEC）缓冲液，用于冷冻EM。 　　实验的总体积为10 µL。使用Prometheus nt.plex仪器（纳米机技术）来测量熔融温度。在384孔板中以0.5 mg-1纯化的重组SARS-COV-2 m和100 µm的JNJ-9676在20 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl，0.001％LMNG（w/v），0.0001％CHS（W/V），0.000 c（v）中（V/v），将样品制备。在25-95°C的温度范围内测量了装入标准级玻璃毛细血管的样品，温度梯度为1°C min -1，并记录了330和350 nm时的内在蛋白质荧光。使用Pr.thermcontrol v.2.1.6（纳米机技术）分析数据（技术复制≥3）。 　　离线ASMS实验包括三种样品类型的制备：化合物QC，蛋白质靶（M蛋白）和无蛋白质控制（突破）。 　　为了制备离线ASM的SEC过滤板，将130 µL的预膨胀的Bio-Gel P10树脂浆液添加到一个低蛋白质结合的Millipore HTS HTS 384 HV滤板（以下简约，尺寸 - 隔离板）的每个孔中，使用0.45 µm Durapore（pvdf）（pvdf）embrane（mzhcn00 n000000）。将尺寸排斥板放入4°C的冷藏离心机中，以1,000克离心2分钟，然后丢弃流动。然后使用50 µL缓冲液洗涤每个墨盒四次，其中含有20 mM HEPE，pH 7.5、150 mm NaCl，0.001％LMNG，0.0001％CHS，0.00033％GDN和2％DMS​​O，每次洗涤的流量均在1,000g的中心后丢弃，为2分钟，每次洗涤都被丢弃了2分钟。使用回声声液体处理程序制备ASMS分析板，并将溶解在100％DMSO中的20 nl的5 mm化合物的等分试样从源板中转移到384-WELL，天然的，天然的聚丙烯V-Bottom v-Bottom板的四个独立孔中（781280）。将纯化的重组M蛋白储备溶液的等分试样融化，然后使用测定缓冲液稀释至5 µM和2％DMS​​O的工作浓度。然后，将20 µL产生的工作蛋白量分配到包含化合物的三孔中，以产生5 µM的最终浓度（3个技术重复）。为了控制SEC树脂的化合物突破，无论是内溶液或胶束分配，准备了一个单独的工作库存，而无需蛋白质，并将其作为20 µL等分试样分配到其余化合物中。将板以1,000克离心1分钟，并在25°C下孵育30分钟。 　　将所有样品转移到尺寸排斥板上，该板在4°C下以1,000克的速度迅速离心2分钟，以最大程度地减少复合突破。将所得的流液用15 µL MS级水（Honeywell）稀释，以降低洗涤剂的浓度，并在室温下以2,000g进一步离心5分钟，以收集任何不溶性沉淀物。 　　分别制备化合物QC样品，而无需其他处理，从而将DMSO中5 mm化合物的5 nL等分试样从源板中转移到384孔板中，并与25 µL的49％乙腈，2％DMS​​O溶液结合使用。 　　所有液态色谱 - 质谱法（LC -MS）分析均在安捷伦1290 Infinity II UHPLC系统上进行，该系统与Agilent MassHunter（v.10.0）软件耦合到Agilent 6545xt QTOF。将4 µL样品注入装载水作为载荷溶剂到相反的相位柱（2.1×35 mm释放uplc beh c18柱，130Å，1.7 µm），加热至40°C。使用由水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成的移动相进行LC分离，每个相位含有0.2％甲酸。LC方法使用的恒定流速为0.1 ml min -1，由1分钟的洗涤液和5％溶剂B洗涤，陡峭的梯度在0.1分钟内从5％到20％B，随后在1.9分钟内从5％到95％B的浅梯度在1.9分钟内，持续1分钟，然后在0.1分钟内恢复到5％B，并在0.1分钟内恢复为5％。MS仪器以正极模式运行，并采用质心数据采集，其中源设置为350°C的干燥气体温度和13 L min -1的干燥气体流速；375°C的鞘温度温度和12 l min -1的鞘液流量；毛细管电压为3,300 V；喷嘴电压为500 V；雾化器压力为50 psi；125 V的碎片;和50 V的撇渣器。根据制造商的说明，制备了由嘌呤和HP-0921（Agilent，G1969-85001）组成的参考质量解决方案（Agilent，G1969-85001），并注入了以每秒1个光谱速率从110到1,100 m/z获取的所有光谱进行自动质量校正。 　　使用Agilent MassHunter定性分析（V.10.0）进行MS数据处理，其中[M+H]+，[M+Na]+和[M+K]+质量被提取并使用3 ppm的质量误差窗口合并。 　　使用Pelco Easiglow排放清洁系统，对Quantifoil Au 1.2/1.3 300网格网格进行光泽放电。如上所述，将总共3 µL重组M蛋白样品（0.8 mg ml -1）应用于EM网格，使用以下设置将其用玻璃体（Thermo Fisher Mark IV）粘合到EM网格上：blot Time 4 s，blot time 4 s，blot力量0，等待时间0，等待时间0 s，等待时间0 s，内部室内温度4°C和100％相对效果。通过液氮冷却的液体乙烷中的闪光冻结。Cryo-EM数据收集是在由EPU软件控制的200 kV Thermo Scientific Glacios显微镜上自动化的。使用FACON4检测器（GATAN）以计数模式以×105,000的放大倍率拍摄显微照片。每6 s暴露记录40帧，总剂量为40 e -Å -2。所有数字显微照片的校准物理像素尺寸为0.910Å。与单个数据集相对应的所有详细信息均在扩展数据表6中汇总。 　　使用CryoSparc Live v.3.2监视冷冻EM数据收集和图像质量。同时执行图像预处理步骤，包括斑块运动校正，斑块对比度转移函数（CTF）估计，斑点粒子拾取（直径100-200Å）和提取。在为期4天的数据收集会话中，使用Glacios显微镜记录了总共12,988个原始显微照片。可接受的2D类是粒子重新攻击的模板。一轮现场2D图像分类产生了约120万个良好的粒子图像。这些颗粒用于3D重建。计算了五个启动3D模型的第一轮，导致了一个主要的3D类，其次是四个3D类的第二轮。一种主要类别使用484,610个颗粒进行了不均匀的3D细化和局部改进，并进一步精制成3D EM地图，平均分辨率为3.06Å。 　　通过使用金色标准（独立的数据的两半精制）fsc = 0.143标准，通过在蛋白质复合物密度周围施加软面膜来估计分辨率。在可视化之前，通过应用不同的负温度因子以及半图，并用于建造模型，可以锐化所有密度图。使用Resmap确定局部分辨率。有关冷冻EM数据处理的详细统计数据可以在扩展数据中找到图6a – f。 　　与Fabb（PDB：7VGS）复合物中的人类SARS-COV-2 M蛋白二聚体（短形式）用作EM图的原子模型构建的初始模型。对于M – FABB复合模型构建，M蛋白是使用COOT68手动构建的。使用嵌合体将FABB安装到3D地图中，然后用COOT手动进一步完善，然后在Phenix69中进行真实空间的细化。详细的数据收集和结构改进统计数据在扩展数据表6和扩展数据中提供了图6G。使用Pymol（V.2.0）70和Chimera71生成结构表示。 　　住房条件和实验程序是根据项目062/2020的项目进行的，该项目获得了比利时卢文伦理委员会的批准，比利时许可证号LA1210186。先前已经描述了SARS-COV-2的仓鼠感染模型72。统计能力分析以及研究规模的局限性每组需要5只动物，以在叙利亚金仓鼠研究中获得统计学意义。到达后，将动物随机分配给组。在实验过程中未进行盲目性。雌性仓鼠（Janvier Laboratories）为8-10周，在鼻内接种了50μl，其中含有2×106 TCID50 SARS-COV-2 B1（第0天）。根据时间表（图3A）对动物进行处理，并用媒介物或JNJ-9676（每剂剂量75、25或8.33 mg，在100％PEG400中配制）。动物在08:00和16:00出价。如先前所述，使用RT-QPCR和终点病毒滴定对右肺的病毒RNA和右肺传染性病毒水平进行定量，而左肺样品进行了组织病理学评分，如前所述72（图3B – E）。 　　为了进行组织学检查，用血久毒素和曙红染色后，分析了固定的肺组织切片（5μM），并盲目评分专家病理学家肺损伤。评分参数（累积得分为1至3）如下：充血，肺泡内出血，支气管壁中的凋亡人体，凋亡人性身体，坏死性支气管炎，周围血管性炎，支气管内肿瘤，支气管障碍，支气管炎，骨膜内脑血管病性炎症，脑膜炎，血管症，血管症，血管症。 　　所有统计分析均在GraphPad Prism v.9.5.0中进行，并使用R（V.3.6.1）验证。将log10转化应用于肺病毒载荷数据（RNA和感染性病毒）以近似正态性。使用与šídák的多重性校正的单向方差分析估算治疗组与车辆组之间的平均差异，以说明多次测试。 　　如果不能假定结果变量或肺组织病理学，则应用非参数Kruskal -Wallis检验。Benjamini -Hochberg的多重性校正进行了多次测试，对Benjamini – Hochberg的多重性校正进行了多次测试。使用了0.05的显着性水平。 　　住房条件和实验程序如约翰逊和约翰逊研究与发展（BELGIUM）的伦理委员会所述和批准，LA1100119。统计能力分析以及研究规模的局限性每组需要5只动物，以在叙利亚金仓鼠研究中获得统计学意义。到达后，将动物随机分配给组。在实验过程中未进行盲目性。叙利亚雌性金仓鼠（Janvier Laboratories）8-10周通过异氟烷吸入，并用含有1×104 TCID50 SARS-COV-2的100μlPBS内汇总接种，并在内部接种。从10、24或48 H.P.I.开始口服这些动物。并继续以10 h或JNJ-9676（PEG400中的每千克75毫克）的速率间隔10小时出价（图3F）。这些动物在08:00和16:00出价。在感染后的第4天，仓鼠通过二氧化碳吸入式安乐死。使用先例均质器（Bertin Instruments），通过珠子破坏将整个右肺均质。RT-QPCR和终点病毒滴定分别在肺匀浆上清液中定量病毒RNA和传染性病毒水平（图3G，H）。使用Magna Pure 96 DNA和病毒NA小体积试剂盒提取RNA，遵循病毒NA通用SV 4.0方案（Roche）。如上所述，使用LightCycler多重RNA病毒主试剂盒（Roche）和SARS-COV-2引物和探针进行RT-QPCR。对于终点滴定，以1×MEM（不含2％FCS（Biowest），2 mM丙氨酸（Sigma-Aldrich）和0.04％gentamicin（Thermo Fishericixic cocientific）的1×MEM（不含苯酚红（Thermo Fisher Scientific），制备了1:10肺匀浆的连续稀释。。然后将该稀释术语添加到96孔板中的汇合E6细胞中，并在37°C下孵育72小时。样品的传染性病毒滴度通过显微镜评分病毒诱导的细胞病变作用确定，并根据REED-MUENCH计算方法将其定量为TCID50 ML-1。将TCID50 mL -1值标准化为右肺的总重量，并表示为每毫克组织TCID50。 　　如上所述进行统计分析。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。